唐艷婷 張琪

1蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院口腔科 215000；2北京大學(xué)國際醫(yī)院口腔頜面外科 100850

由于外傷、腫瘤及感染等原因造成的骨組織缺損是口腔頜面外科常見的臨床問題。再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為骨缺損的治療帶來了新的希望。自2001年Zuk等［1］首次通過人抽脂術(shù)獲得脂肪組織并從中分離出具有多向分化潛能的人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞以來，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）成為對再生醫(yī)學(xué)種子細(xì)胞研究的又一熱點(diǎn)。在對ADSCs的研究中，最為肯定的研究成果是其向成骨誘導(dǎo)分化。盡管ADSCs對于增強(qiáng)骨修復(fù)的有效性在臨床試驗(yàn)中還未被研究過，但是已有報(bào)道證明了ADSCs在各種動物模型中具有增強(qiáng)骨愈合的作用［2-5］。近年來，隨著對碳納米材料研究的不斷深入，以碳納米管、石墨烯、富勒烯衍生物-富勒醇等為代表的碳納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景，如抗氧化性、腫瘤治療和組織工程等［6］。有研究表明抗氧化劑具有增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用，如Liu等［7］研究發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)氧化性的富勒醇能夠激活小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞系（D1）成骨基因的表達(dá)。Yamada等［8］在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究中均表明了抗氧化的小分子N-乙酰半胱氨酸具有增強(qiáng)大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的成骨和骨再生的作用?；谏鲜鲅芯?，我們來探討富勒醇對大鼠ADSCs生物活性和成骨分化的影響，以期提高大鼠ADSCs成骨分化效率，為口腔頜面創(chuàng)傷中基于再生醫(yī)學(xué)的組織工程治療骨缺損和修復(fù)帶來新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠［雄性，（80±20）g］，由中國軍事醫(yī)學(xué)科院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 材料與試劑 富勒醇、油紅“O”（中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所前沿交叉學(xué)科實(shí)驗(yàn)室）；α-MEM（美國Gibco公司），胎牛血清（FBS）（美國MD genics公司），0.1%膠原酶Ⅰ（德國Roche Diagnostics公司），0.25%和0.05%胰酶、10 mmol/L的β-磷酸甘油鈉、50μmol/L抗壞血酸磷酸鹽、0.1μmol/L地塞米松、0.5μmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、200μmol/L的吲哚美辛、10μg/ml的胰島素；抗體：CD29、CD45、CD90（美國Biolegend公司）、CD34（美國Santa公司）、CD31（美國Sigma公司）。Alizarin Red S（美國Sigma公司）；Live/Dead細(xì)胞活力試劑盒（美國Life Technologies公司）；引物序列（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）；ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix（日 本TOYOBO公 司）、TransStart?Top Green qPCR SuperMix（中國全式金公司）。

1.3 儀器與設(shè)備 流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；FTC-3000P Real-Time Quantitative Thermal Cycler（加拿大FB公司）

1.4 方法

1.4.1 大鼠ADSCs分離、培養(yǎng)及傳代 取SD大鼠斷頸處死，75%乙醇消毒，移至超凈臺。無菌條件下切取雙側(cè)腹股溝處的脂肪組織，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）反復(fù)沖洗，充分剪碎，用0.1%膠原酶Ⅰ+0.05%胰酶在37℃攪拌條件下消化40 min；終止消化，篩網(wǎng)過濾；800×g離心8 min，去上清，加入10%FBS+α-MEM制備細(xì)胞懸液；以2×105個(gè)/cm2接種到大皿中，置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，以后每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)90%后，胰酶消化收集細(xì)胞，以1∶3的比例進(jìn)行傳代，傳代到P3代進(jìn)行使用。

1.4.2 大鼠ADSCs的免疫表型特征鑒定 取P3代以后細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測：取P3代細(xì)胞進(jìn)行，胰酶消化收集細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，分裝到2 ml干凈的塑料離心管中，按照CD29、CD45、CD90、CD34、CD31的抗體說明書分別加入抗體，37℃暗處孵育30 min，加入適量的PBS，離心、洗去抗體，加入400μl PBS重懸細(xì)胞，混勻后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢查，用Cell-Quest軟件進(jìn)行分析。

1.4.3 大鼠ADSCs成脂、成骨多向誘導(dǎo)分化 將P3代細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種到24孔板中，貼壁24 h后，分別更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（0.5μmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、200μmol/L的吲哚美辛、1μmol/L地塞米松、10μg/ml的胰島素）和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（0.1μmol/L地塞米松、50μg/ml維生素C、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉），以正常培養(yǎng)基作為對照組誘導(dǎo)14 d后，進(jìn)行油紅“O”染色和茜素紅染色來檢測成脂、成骨多向分化潛能，光鏡下隨機(jī)取圖。

1.4.4 Live/Dead細(xì)胞活力檢測 將P3代細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種到24孔板中，貼壁24 h，更換為加入含有不同濃度（0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L、100.0μmol/L）富勒醇的培養(yǎng)基（每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔），培養(yǎng)48 h，按照Live/Dead細(xì)胞活力試劑盒的說明書進(jìn)行大鼠ADSCs活力檢測：去除培養(yǎng)基，PBS沖洗3×，用PBS稀釋的Live/Dead染液進(jìn)行細(xì)胞的孵育（37℃，避光）15 min。孵育結(jié)束后，PBS沖洗3×除染液。加200μl PBS/孔，萊卡熒光顯微鏡下從每個(gè)濃度的3個(gè)復(fù)孔中隨機(jī)獲取10張細(xì)胞存活圖像。通過ImageJ2x軟件進(jìn)行合圖并統(tǒng)計(jì)獲得細(xì)胞存活比例圖。

1.4.5 富勒醇誘導(dǎo)大鼠ADSCs的成骨分化 將P3代細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種到24孔板中，貼壁24 h后，更換為成骨培養(yǎng)基將各孔分為兩組：實(shí)驗(yàn)組（成骨培養(yǎng)基＋富勒醇，1.0μmol/L）和對照組（成骨培養(yǎng)基），各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在誘導(dǎo)14 d、21 d后進(jìn)行茜素紅染色檢測富勒醇對大鼠ADSCs成骨分化影響，鏡下隨機(jī)取圖。

1.4.6 實(shí)時(shí)定量PCR（q-PCR）檢測 將P3代細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度分別接種到6孔板，貼壁24 h后，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將各孔分為兩組：實(shí)驗(yàn)組（成骨培養(yǎng)基＋富勒醇，1.0μmol/L）和對照組（成骨培養(yǎng)基），各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。兩組分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)14 d、21 d后除6孔板中的培養(yǎng)基，PBS沖洗1×，每孔中加入1 ml Trizol，按試劑說明提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測總RNA在A260和A280的吸光度，進(jìn)行RNA濃度和純度的測定。采用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix體 系 合 成cDNA第 一 鏈。采 用TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒在Real-Time Quantitative Thermal Cycler儀器中進(jìn)行q-PCR檢測。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃，2 min；變性94℃，20 s，60℃，10 s，72℃，20 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用FTC-3000P的分析軟件，分析各基因表達(dá)的相對定量，獲得各樣本中靶基因mRNA的相對含量。引物序列如表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。Lived/dead細(xì)胞活性統(tǒng)計(jì)分析采用one-way ANOVA，實(shí)驗(yàn)組與對照組中成骨分化基因的表達(dá)比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠ADSCs的細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察，剛分離獲得的原代大鼠ADSCs呈圓形，大部分漂于培養(yǎng)基中。48 h后細(xì)胞貼壁生長，呈短小梭形。細(xì)胞換液后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞逐漸伸展為長梭形。以1∶3傳代到P3代大鼠ADSCs細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞形態(tài)均一成漩渦狀排列（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下P3代大鼠ADSCs的細(xì)胞圖（標(biāo)尺＝50μm）

2.2 大鼠ADSCs的免疫表型鑒定P3代細(xì)胞經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，分離、傳代培養(yǎng)到P3代的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29、CD90陽性率高；但是不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45、CD34等標(biāo)志（圖2），這說明P3代的大鼠ADSCS具有間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型特征，且純度高。

圖2 大鼠ADSCs流式細(xì)胞檢測

2.3 大鼠ADSCs多向分化能力鑒定 成脂誘導(dǎo)14 d后，大鼠ADSCs胞漿內(nèi)出現(xiàn)圓形透亮串珠樣的脂滴。通過油紅“O”染色，正常對照呈陰性（圖3A），成脂誘導(dǎo)組脂滴被染成橘紅色（圖3B）。成骨誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞增殖變慢，細(xì)胞呈短梭形。通過茜素紅染色，成骨誘導(dǎo)組可見紅色的鈣化結(jié)節(jié)即表現(xiàn)為陽性（圖3C），而正常對照組呈陰性（圖3D）。

2.4 Live/Dead細(xì)胞活力檢測Live/Dead實(shí)驗(yàn)檢測顯示，在正常培養(yǎng)的大鼠ADSCs中，幾乎無死亡的細(xì)胞（紅色，代表死細(xì)胞），大部分細(xì)胞保持較好的細(xì)胞活性（綠色，代表活細(xì)胞）（圖4A）。不同濃度富勒醇處理48 h后結(jié)果顯示，當(dāng)富勒醇濃度達(dá)到10.0μmol/L并沒有引起大鼠ADSCs細(xì)胞的死亡（圖4B～D），達(dá)到100.0μmol/L時(shí)可見出現(xiàn)死細(xì)胞數(shù)量較多且細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A球形狀（圖4E），鏡下可見培養(yǎng)基中漂浮少量死細(xì)胞。ImageJ2x軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率制作統(tǒng)計(jì)圖（圖4F）同樣表明了1.0～10.0μmol/L，細(xì)胞間存活率無明顯差異，在100.0μmol/L時(shí)細(xì)胞活性明顯降低。

2.5 富勒醇對大鼠ADSCs成骨分化的茜素紅染色1.0μmol/L富勒醇作用于成骨誘導(dǎo)的大鼠ADSCs 14 d和21 d后，經(jīng)過茜素紅染色結(jié)果顯示，與成骨培養(yǎng)基對照組相比，成骨培養(yǎng)基＋富勒醇，1.0μmol/L實(shí)驗(yàn)組的大鼠ADSCs形成了更多鈣化的結(jié)節(jié)，被茜素紅染色呈紅色（圖5）。

2.6 q-PCR檢測1.0μmol/L富勒醇作用于成骨誘導(dǎo)的大鼠ADSCs 14 d和21 d后，與成骨培養(yǎng)基對照組相比，成骨培養(yǎng)基＋富勒醇，1.0μmol/L實(shí)驗(yàn)組中大鼠ADSCs細(xì)胞中與成骨相關(guān)基因Runx2、骨鈣素（OCN）、Ⅰ型膠原（ColⅠ）的表達(dá)均提高（圖6），說明富勒醇對于大鼠ADSCs成骨分化具有促進(jìn)的作用。

表1 q-PCR引物序列表

圖3 大鼠ADSCs多向誘導(dǎo)分化能力圖。油紅“O” 染色：A為對照組（成骨培養(yǎng)基），B為實(shí)驗(yàn)組（成骨培養(yǎng)基＋富勒醇，1.0μmol/L）（標(biāo)尺＝100μm）；茜素紅染色：C為對照組，D為實(shí)驗(yàn)組（標(biāo)尺＝100μm）

圖4 Live/Dead檢測圖。A～E為Live/Dead熒光染色圖（A為0μmol/L富勒醇，B為0.1μmol/L富勒醇，C為1.0μmol/L富勒醇，D為10.0μmol/L富勒醇，E為100.0μmol/L富勒醇），紅色代表死細(xì)胞，綠色代表活細(xì)胞（標(biāo)尺＝100μm）；F為Live/Dead細(xì)胞存活率統(tǒng)計(jì)圖（與富勒醇濃度為0μmol/L的空白對照組相比，僅100.0μmol/L的富勒醇P＝0.001）

3 討 論

種子細(xì)胞是組織工程研究的基礎(chǔ)，也是制約其發(fā)展的瓶頸，主要的原因是一些細(xì)胞的供體來源少，增殖能力有限，因此無法實(shí)現(xiàn)通過大量的進(jìn)行體外擴(kuò)增細(xì)胞來構(gòu)建大塊組織［9］。而大鼠ADSCs與其他種子細(xì)胞相比，具有取材方便、來源充足、創(chuàng)傷小、細(xì)胞增殖快、無免疫排斥反應(yīng)同時(shí)不涉及醫(yī)學(xué)倫理等問題，因此患者易于接受；在特定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，是目前最常用的種子細(xì)胞［10-12］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用胰酶消化法獲得原代大鼠ADSCs，對P3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測干細(xì)胞免疫原性，通過成脂、成骨誘導(dǎo)分化檢測多向分化能力，以驗(yàn)證分離、傳代培養(yǎng)的細(xì)胞為純度高的，具有多向分化潛能的干細(xì)胞。

近年隨對碳納米材料研究的不斷深入，各類富勒烯被用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的研究，他們在納米生物技術(shù)和納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用［13］。但是富勒烯因其水溶性差，使其生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用嚴(yán)重受限，而作為富勒烯水溶性衍生物的富勒醇由于制備簡單且具有強(qiáng)大的水溶性［14］。因此富勒醇被認(rèn)為是富勒烯用于生物醫(yī)學(xué)研究中最佳的候選者［15］。我們目前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示富勒醇作用于大鼠ADSCs在劑量達(dá)到10.0μmol/L仍是沒有細(xì)胞毒性的，達(dá)到100.0μmol/L對細(xì)胞形態(tài)及活性會有一定影響，這與目前作用于其他組織和細(xì)胞的研究結(jié)果基本是一致的［16-18］。而當(dāng)劑量更高時(shí)是否對細(xì)胞具有致死性，以及這種致死性是否存在劑量和時(shí)間的依賴性還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

Runx2是骨細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化對骨組織的形成和重建具有重要的作用［19］。而ColⅠ是成骨細(xì)胞分泌的基質(zhì)，是鈣鹽沉著和細(xì)胞附著的支架［20］它在增殖期即開始表達(dá)，基質(zhì)合成期達(dá)到高峰。OCN是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，在骨礦化期表現(xiàn)為高度增加，而后開始逐漸降低［21-22］。在本研究中，基于已有的研究報(bào)道，結(jié)合對大鼠ADSCs進(jìn)行的細(xì)胞生物活性的檢測，我們選擇使用較高濃度的富勒醇（1.0μmol/L）作為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行其對大鼠ADSCs成骨分化的影響。通過茜素紅染色定性分析，富勒醇具有促進(jìn)大鼠ADSCs成骨分化的作用。采用q-PCR技術(shù)我們定量分析成骨分化基因Runx2/OCN/ColⅠ在大鼠ADSCs中的表達(dá)，結(jié)果表明與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中3種基因的表達(dá)量均增高，這與茜素紅染色結(jié)果相一致。而富勒醇對于促進(jìn)大鼠ADSCs向成骨分化的作用，是否與劑量相關(guān)還須進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。若將富勒醇作為用于增強(qiáng)骨再生治療的新型藥物的候選者，需要進(jìn)一步開展富勒醇處理的ADSCs移植到體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)其骨再生的作用效果。

目前已有眾多的研究表明，氧化應(yīng)激可能是調(diào)控成脂和成骨的一個(gè)關(guān)鍵因子。Dugan等［23］表明水溶性富勒烯衍生物可以在家兔骨性關(guān)節(jié)炎模型中作為保護(hù)劑對抗應(yīng)激和代謝相關(guān)的關(guān)節(jié)軟骨退變。Barbagallo等［24］研究表明，抗氧化基因血紅素加氧酶-1（HO-1）能夠抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂作用促進(jìn)其成骨。Liu等［7］研究表明，富勒醇可通過降低氧化應(yīng)激的水平來減少骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化，促進(jìn)成骨分化。本研究雖然已經(jīng)證明了富勒醇具有促進(jìn)大鼠ADSCs成骨分化的作用，但是其中相關(guān)的機(jī)制需進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入的研究，以為富勒醇作為口腔頜面部骨缺損修復(fù)治療中新型藥物提供更加可靠的證據(jù)。

圖5 富勒醇處理后大鼠ADSCs茜素紅染色圖（標(biāo)尺＝100μm）。A為對照組（成骨培養(yǎng)基）14 d，B為實(shí)驗(yàn)組（成骨培養(yǎng)基＋富勒醇，1.0μmol/L）14 d，C為對照組21 d，D為實(shí)驗(yàn)組21 d

圖6 q-PCR測定成骨基因在大鼠ADSCs中的表達(dá)。A為實(shí)驗(yàn)組（成骨培養(yǎng)基＋富勒醇，1.0μmol/L）與對照組（成骨培養(yǎng)基）14 d的成骨基因Runx2的表達(dá)相比（aP＝0.023，bP＝0.001）；B為實(shí)驗(yàn)組與對照組21 d成骨基因OCN的表達(dá)相比（aP＝0.003）；C為實(shí)驗(yàn)組與對照組14 d的成骨基因ColⅠ的表達(dá)相比（aP＝0.008，bP＝0.005）

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。