宋相泉 賴劍秀 徐菊芳 段達榮

(1杭州市西湖區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科 浙江杭州 310000；2臺州市第一人民醫(yī)院檢驗科 浙江臺州 318020)

肺炎鏈球菌是兒童社區(qū)獲得性感染的重要病原菌，可導致肺炎、氣管炎、鼻竇炎和中耳炎等非侵襲性感染，以及腦膜炎、敗血癥和膿毒癥等侵襲性肺炎鏈球菌疾病(invasivepenemococcal diseases，IPD)，是導致全球兒童感染和死亡居高不下的主要原因之一，IPD每年可導致全球100萬人死亡[1]。據(jù)報道，中國 5 歲以下兒童肺炎病例中肺炎鏈球菌檢出率為5.2～11.0%[2]，為保障兒童健康，世界衛(wèi)生組織(WHO)將肺炎鏈球菌疾病列為需“極高度優(yōu)先”使用疫苗預防的疾病[3-4]。攜帶ermB基因S.pn不斷增加的耐藥趨勢和播散形勢引起廣大臨床工作者的關(guān)注，已成為全球性公共衛(wèi)生問題。在對耐藥機制研究的同時，研究人員正在采用MLST方法對菌株的播散特征進行分子流行病學研究，追蹤菌株間的遺傳特性和宏觀進化過程。該研究將臨床分離的攜帶ermB基因肺炎鏈球菌進行血清學型鑒定及多位點序列分型(MLST)，為疫苗免疫預防的可行性及菌株的流行病學提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1研究對象

選取2018年1月至2019年6月杭州市西湖區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院保存的下呼吸道感染患者分離的肺炎鏈球菌，符合條件的菌株59例。其中男36例，平均年齡33.64±16.82月;女23例，平均年齡24.83±16.97月。

納入標準：①患者年齡≤5歲，剔除重復菌株；②ermB耐藥基因檢測陽性；③病人信息記錄完善者。

1.2 儀器與試劑

臺式高速離心機(PICO 17)，超微量分光光度計(NANO-DROP)，核酸電泳儀(PAC 3000)，凝膠成像系統(tǒng)(GIS-1600)， 擴增儀(ABI 7500PCR)，二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-15CA)。青霉素、頭孢曲松及頭孢噻肟E-test 試條均購自溫州康泰生物科技有限公司，引物由合肥麟美生物科技有限公司代為合成。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 肺炎鏈球菌在哥倫比亞血瓊脂平板上培養(yǎng)24 h，傳代后收集整個血平板上菌落，用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取基因組DNA。

1.3.2 PCR引物 ①aroE(405bp) Forward： 5′-GCC TTT GAG GCG ACA GC；②gdh(460bp) Forward： 5′-ATG GAC AAA CCA GC(G/A/T/C) AG(C/I) TT；③gki(483bp) Forward： 5′-GGC ATT GGA ATG GGA TCA CC；④recp(450bp) Forward： 5′-GCC AAC TCA GGT CAT CCA GG；⑤spi(474bp) Forward： 5′-TTA TTC CTC CTG ATT CTG TC；⑥xpt(486bp) Forward： 5′-TTA TTA GAA GAG CGC ATC CT；⑦ddl(441bp) Forward： 5′-TGC (C/T)CA AGT TCC TTA TGT GG。

1.3.3多價疫苗分類 多價疫苗PCV7是指：(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)；PCV13是指在PCV7基礎(chǔ)上增加血清型(1、3、5、6A、7F、19A)。

1.3.4 肺炎鏈球菌血清學分型及耐藥基因檢測 采用PCR方法檢測大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB和mefA/E；多種PCR反應體系來鑒定常見的19種S.Pn血清型，體系1可鑒定6A/B、9V、15B/C、18C及19F血清型；體系2可鑒定3、14、19A及23F；體系3可鑒定1、4、5、23A；體系4可鑒定15A、7F及22F；體系5可鑒定20、34及33F。

1.3.5多位點序列分型MLST 將肺炎鏈球菌7個管家基因：aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt、ddl的PCR產(chǎn)物分別測序后，運用DNAssist Version 2.2軟件進行數(shù)據(jù)分析。與肺炎鏈球菌MLST數(shù)據(jù)庫(http：//spneumoniae.mlst.net/)中的標準序列進行比對后，在Locus Query中輸入裁剪后的序列，得到allele number。將每個標本的7個allele numbers輸入Profile OuerV(a11elic)，查出相應的ST。

1.4統(tǒng)計學分析

應用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用百分率(%)表示，組間差異用χ2檢驗和Fisher確切概率法，p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1不同年齡組與不同性別血清型及疫苗覆蓋率比較

血清分型主要以3(37.29%)、19A(16.95%)及6A/B(15.25%)為主；不同性別比較，血清型與疫苗覆蓋率均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；不同年齡組比較，血清型3在0～12月、13～36月和37～60月三組之間有統(tǒng)計學意義(p=0.032)，其余血清型不同年齡組比較均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)，見表1。

表1 血清型與疫苗覆蓋率在不同年齡組及不同性別患兒比對[菌株數(shù)(%)]

2.2血清型與ST序列及多重耐藥率構(gòu)成比關(guān)系

S.Pn菌株主要ST分型為ST271(15.25%)、ST505(15.25%)、ST902(6.78%)、ST6989(5.08%)；ST11972、ST3173、ST458各檢出2株，占比均為3.39%；新型ST序列共為2株，占比為3.39%；ST序列各為1株，共有25株，占比合計為42.37%。ST271主要血清型為19A，多重耐藥菌株百分比為44.44%：復方新諾明+四環(huán)素+紅霉素；ST505與ST6989均為血清型3，多重耐藥菌株百分比分別為88.88%與66.67%，ST505主要耐藥模式為：復方新諾明+四環(huán)素+紅霉素+美洛培南；ST902與ST3173血清型均以6A/B為主；多重耐藥菌株百分比均為50.00%；新型ST序列均為6A/B；其它ST序列共有25株，占比42.37%，多重耐藥菌株百分比均為64.00%，詳見表2。S.Pn7個管家基因電泳圖見圖1。

圖1 S.Pn 管家基因 PCR產(chǎn)物電泳圖

3討論

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae) 是革蘭陽性菌，目前已鑒定出97 種莢膜血清型[5]。該研究結(jié)果顯示：血清型主要為3(37.29%)，與江艷霞[5]等報道的血清型3構(gòu)成比為3.8%和劉瑩[6]報道的構(gòu)成比僅為0.8%以及雷磊[7]等報道的血清型主要為19A(70.1%)，在血清型排序和所占比例存在很大的差異，該研究血清型3占比極高，可能原因為：①流動人口的傳播：杭州地區(qū)為省會城市，且經(jīng)濟發(fā)達，國際交流廣泛，人口流動頻繁，這些均促使了血清型3菌株在該地區(qū)的傳播；②另外可能是抗生素選擇壓力，在壓力下菌株可發(fā)生變異，導致莢膜轉(zhuǎn)換；③也可能與國家或地區(qū)引入的疫苗種類不同有關(guān)。不同年齡組血清型3在三組之間比較差異有統(tǒng)計學意義，其中以13～36月構(gòu)成比最高，37～60月構(gòu)成比最低，由于血清3在PCV13范疇內(nèi)，因此13～36月兒童更應加強PCV13疫苗接種。另外，該研究發(fā)現(xiàn)：血清型在不同性別間差異無統(tǒng)計學意義，因此當?shù)貙W齡前兒童S.Pn疫苗的接種，可以不用考慮性別的差異。

該研究的PCV13疫苗覆蓋率遠高于PCV7疫苗覆蓋率，主要原因為該實驗中血清型3和19A占比很高，且都屬于PCV13疫苗范疇。另外，研究發(fā)現(xiàn)：PCV13覆蓋率均高于Zhou HJ[8]等報道的89.3%和Lyu S[9]等報道的87.8%，PCV7均低于劉勇[10]等報道的57.4%及李靜[11]等報道的76.1%；對于PCV覆蓋率的差異，Kim[12]等報道指出可能與地區(qū)差異有關(guān)。鑒于該研究中的PCV13的覆蓋率高，且未在PCV13范疇的22F，占比僅為1.69%，提示當?shù)貎和茝V接種PCV13疫苗能有效預防肺炎鏈球菌感染，對控制該菌耐藥性的播散也有重要的意義。

多位點序列分型(MLST)是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，操作簡單，結(jié)果快速，并且便于不同實驗室的比較。目前已經(jīng)用于多種細菌的流行病學監(jiān)測和進化研究，隨著分析軟件的發(fā)展，測序速度加快和成本降低，MLST逐漸成為細菌的常規(guī)分型方法。該次MLST分型共檢出35種ST，以ST505與ST271菌株數(shù)量最高，構(gòu)成比均為15.25%，隨后依次為ST902(6.78%)，ST6989(5.08%)與ST11972(3.39%，與張敏[13]等及王樂雨[14]等報道的S271均為優(yōu)勢群，占比最高一致，但ST505無論在排序還是構(gòu)成比方面與兩者的報道都存在著很大的差異。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，此次分離的ST505血清型均為3型，推測ST505與血清型3存在著高度相關(guān)性，相關(guān)性程度和機制有待于進一步研究，ST271菌株血清分型中，以19A為主(44.44%)；ST320、ST236與ST81各檢出一株，對應的血清型分別為3、19A和19A，與Zhou H[15]等報道的ST271、ST3173、ST320、ST236、ST81分別與血清型19F、19A、6A、19F、1高度關(guān)聯(lián)性，存在著一定的差異。S.pn分子流行病學網(wǎng)(http：//www.sph.emo ry.edu/pmen)目前已確認43個S.pn克隆株[16]。此次檢測的ST菌株中有19株歸屬于流行克隆菌株，其中ST505(9株)為CC505群，ST271(9株)和ST320(1株)為CC271群，其他ST序列分布比較散開，說明該地區(qū)S.pn 在基因水平上有著不同程度的多樣性與復雜性。本實驗中ST271、ST505與ST320均為國際流行克隆菌株，ST320僅分離到1株，其余均為ST271與ST505，ST505菌株多重耐藥百分比明顯高于ST271，可能與該次ST505菌株血清型均為3有關(guān)，張艷琳[17]等指出：3 型肺炎鏈球菌在增殖的過程中會產(chǎn)生更多的莢膜多糖，進而形成更強的抗吞噬功能。此外，3型肺炎鏈球菌更容易進入腦脊液進而引發(fā)炎癥，導致毒性基因的轉(zhuǎn)錄水平升高。鑒于ST505作為該地區(qū)較為流行的耐藥克隆群，給本地區(qū)S.Pn的感染治療帶來極大的困難，臨床應給予更多的關(guān)注。

不足之處：研究的59株S.pn當中，有2株未能血清定型，可能原因為莢膜之間發(fā)生轉(zhuǎn)換，導致該研究采用的PCR血清分型方法未能覆蓋其血清型；另有1株因ddl位點基因未測出，而未能ST序列分型。

總之，該研究中分離的肺炎鏈球菌株主要的流行血清型為3、19A和6A/B。PCV13 疫苗的覆蓋率達到94.92%，提示引入PCV13疫苗對于當?shù)貎和A防和控制肺炎鏈球菌性疾病有重要意義；另外，不同的ST序列菌株產(chǎn)生的多重耐藥性也存在一定的差異，臨床也應引起足夠的重視。