趙鵬宇 白 雪 燕平梅 趙曉東 武曉英 柴寶峰

(1.太原師范學院生物系 晉中 030619 2.山西大學黃土高原研究所 晉中 030006)

同一基因型受不同環(huán)境因子影響而產生不同的表型，這一現(xiàn)象稱為表型可塑性(West-Eberhardetal.，1989)。表型可塑性是生物個體表型變異和生態(tài)適應的基礎，其可使物種在資源充足條件下達到時空上的“表現(xiàn)最大化”，并且在資源受限、存在脅迫的條件下仍然維持必要的生理功能，以確保對環(huán)境異質性的適應度(West-Eberhardetal.，1989；王文曉等，2020)。這種機制使得物種具有更寬的生態(tài)幅和更高的耐受性，可以適應更廣闊的地理范圍和更加多樣化的生境條件(王文曉等，2020；趙孟良等，2020)。生物體表型的變化可以體現(xiàn)在行為上、生理上、形態(tài)上、生長上或生活史上等，也可以跨越世代。目前，關于生物體表型可塑性的研究常見于大型動植物領域的報道(王小藝等，2015；Ackermannetal.，2015)，如昆蟲的翅多型現(xiàn)象(王文曉等，2020)；黑殼白點的螺生活在低鹽分地區(qū)，而白殼黑紋的螺生活在高鹽分地區(qū)等(劉彩云等，2020；魏瑩等，2020；王文曉等，2020)。因此，開展表型可塑性研究對理解種群的適應性十分重要(朱璟等，2019)；也對保護生態(tài)環(huán)境、維持物種共存有很重要的生態(tài)意義(王小藝等，2015)。

表型可塑性在生物界普遍存在，但在微生物領域的研究卻相對較少。微生物具有個體微小、代際周期短、生長極其迅速、種類繁多、存在橫向基因轉移等獨特的生理特性。有研究指出，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)能夠依據(jù)環(huán)境變化在生理表型方面主動做出對環(huán)境信號的多樣性響應(朱璟等，2019)。即使生存在同一生境的微生物，也可能產生表型的差異(Ackermannetal.，2015)。因此，以微生物群落為研究對象，可以為表型可塑性研究提供更多的理論線索。土壤理化性質不但能夠驅動微生物群落的多樣性、種類和結構發(fā)生巨大變化(趙鵬宇等，2018；Zhaoetal.，2019b；2019c)，而且會對微生物群落功能產生深遠影響(趙鵬宇等，2018；Zhaoetal.，2019c；王瑞宏等，2018；段鵬等，2020)。但是，關于土壤理化性質對微生物群落結構和表型變化的影響研究還很少報道。因此，研究土壤理化因子對微生物群落結構和表型的影響，能為理解微生物的環(huán)境適應機制提供一定的理論支持。

基于此，為揭示土壤細菌群落的結構與表型的關系及其對土壤異質性的響應機制，本研究做出以下3個假設：1)五臺山、蘆芽山和關帝山的環(huán)境因子存在顯著差異；2)細菌群落的結構和表型對環(huán)境異質性的響應程度各不相同；3)細菌群落的結構和表型在空間分布格局上具有一致性。對所采取的土壤樣品通過高通量測序、BugBase分析、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等，旨在探明不同研究站點中土壤細菌群落的結構、表型變化，及二者對土壤異質性的具體響應機制，從而有助于理解微生物適應環(huán)境的機制。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于山西省境內的華北落葉松集中分布區(qū)，屬北溫帶大陸性氣候，氣候寒冷干燥，多大風，四季分明，冬季漫長，無霜期短，晝夜溫差大。植被類型為寒溫性針葉混交林、針闊混交林和溫性闊葉混交林。依建群種大致可分為5種類型：華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)天然次生林純林、云杉(Piceaasperata)林、油松(Pinustabulaeformis)林、遼東櫟(Quercusliaotungensis)林、山楊(Populusdavidiana)、紅樺(Betulaalbosinensis)闊葉林。研究區(qū)土壤以褐土、山地棕壤、亞高山草甸土為主。

2 研究方法

2.1 樣方設置

研究樣方選擇華北落葉松純林內，目的是減少植被類型等未知因子的干擾。具體樣方數(shù)量：五臺山葉斗峰8個、關帝山龐泉溝自然保護區(qū)10個、蘆芽山5個，各站點的地理信息見表1。

表1 研究區(qū)樣地位置信息①Tab.1 The location of sampling plots

為選擇較強的環(huán)境異質性，將樣方建立在特定海拔梯度上，這樣可在較短距離內有較大的氣候梯度，從而為細菌群落的結構和表型響應環(huán)境異質性的研究提供理想的試驗條件。

野外采樣時，在每個1 m×1 m的樣方中，采用S型采樣法，隨機選取5個土芯(深度15 cm)，然后混合為一個樣本?；旌贤翗颖幻芊庠谧苑獯胁⒗洳?，立即送往實驗室。土壤樣本用篩子濾過植物根系和碎石塊，一部分土樣儲存在-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)的高通量測序；另一部分樣本放置在陰涼的實驗臺上，自然風干，用于測定土壤理化性質。

2.2 土壤環(huán)境因子分析

使用儀器HANNA HI3221 pH儀(加拿大)測定土壤pH值(1∶2.5的土/水質量比的土壤懸浮液)(趙鵬宇等，2018)；使用vario MACRO cube元素分析儀(德國)測定土壤總氮、總碳和總硫含量(Zhaoetal.，2019a)；使用間斷式元素分析儀(德國；CleverChem 380)測定土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量。采用重鉻酸鉀-外加熱法測定土壤有機碳含量(趙鵬宇等，2018)。

2.3 DNA提取和PCR擴增及測序

使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒(OMEGA,USA)提取土壤DNA。每個樣本采用25 μL的擴增體系：PCR擴增體系主要包括：0.5 μL的PlantiumTaq(5 U·μL-1)、5.0 μL的10 × EasyTaq Buffer(Mg2+Plus)、4.0 μL的dNTPs、0.5 μL的引物(50 μmol·L-1)，加入5.0 μL的DNA模板和無菌水至50 μL的反應體系。PCR擴增的反應條件：95 ℃預變性3.0 min；95 ℃變性30 s，30個循環(huán)；62 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃最后延伸5 min。使用酶標儀Infinite200 PRO(TECAN,Switzerland)測定DNA提取物的純度和濃度。只有測定值的A260/A280吸光度位于1.8～2.0之間時，才能用于下一步試驗分析。從每個土樣中提取3個DNA樣品，充分混合并送至上海派森諾生物技術工程有限公司進行高通量測序。通過Illumina Miseq測序平臺，對16S rDNA高變區(qū)V3-V4區(qū)進行測序。

2.4 生物信息學分析

使用QIIME軟件(v1.8.0,http:∥qiime.org/)對測序所得數(shù)據(jù)進行分析，具體分析步驟如下。首先對測得的原始數(shù)據(jù)進行拼接、質量控制，然后去除序列中的嵌合體，最終得到高質量序列。使用抽平的方法，避免在分析過程中由于測序深度不同而造成的分析結果偏差。使用 MOTHUR 軟件，采用97%的閾值，對高質量序列進行物種注釋分析。

BugBase分析能基于OTU表和Mapping文件對菌群進行表型預測。它可預測的表型類型包括革蘭氏陽性、革蘭氏陰性、生物膜形成、致病性、移動元件含量、氧需求(包括有氧、厭氧、兼性厭氧)及氧化脅迫耐受等7類(West-Eberhardetal.，1989；趙孟良等，2020；魏瑩等，2020)。

2.5 統(tǒng)計分析

使用單因素方差分析(ANOVA)評估不同研究站點的土壤理化性質、細菌群落組成和菌群表型的差異。利用非度量多維尺度分析(NMDS)對細菌群落結構和表型進行排序分析。在NMDS分析中使用Stress值檢驗NMDS分析結果的優(yōu)劣。通常認為stress<0.2時可用，其圖形有一定的解釋意義。

為了評估環(huán)境因子的多重共線性，計算每個環(huán)境變量(數(shù)據(jù)標準化后)的方差膨脹因子(variance inflation factor，VIF)：使用R語言分析軟件Vegan程序包中的vif.cca函數(shù)，并將VIF >10的環(huán)境因子剔除，最終篩選出pH值、土壤有機碳、總碳和總氮含量作為環(huán)境因子，用于進一步的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。然后通過冗余分析(RDA)研究細菌群落的組成結構、表型與環(huán)境因素之間的關聯(lián)關系。以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析都是使用R語言的Vegan、ggplot2等程序包下的多個函數(shù)完成(Ginestetetal.，2011)。

使用普魯克(Procrustes)分析評估不同站點的細菌物種豐度組成和表型可塑性的空間分布格局的潛在一致性(Zhaoetal.，2019；Peres-Netoetal.，2001)。線段一端實心形狀代表高通量測序數(shù)據(jù)的排序結果，另一端代表表型數(shù)據(jù)的排序結果，連線代表2排序構型的殘差，可評價二者間的變異情況；M2是普魯克分析中2排序結果的擬合優(yōu)度統(tǒng)計量，用于評估2排序結果的相關性，大小范圍為0～1，越接近于0說明2排序結果的相關性越大；P-value由Monte Carlo模擬生成，用于檢驗M2的顯著性。細菌群落的結構、表型和環(huán)境因子之間的相關分析使用R語言ggcor程序包分析并美化。

3 結果與分析

3.1 土壤化學性質的站點差異

土壤化學性質的單因素方差分析(圖1)表明：土壤pH值在龐泉溝最高(6.38)，且和蘆芽山有顯著差異(P<0.05)；最高的銨態(tài)氮含量在蘆芽山(36.91 mg·kg-1)，最低的亞硝態(tài)氮含量在五臺山(0.16 mg·kg-1)，并且2個地點均呈顯著差異(P<0.05)；硝態(tài)氮含量(6.45 mg·kg-1)、土壤有機碳含量(70.29 mg·kg-1)和總氮含量(0.57 mg·kg-1)均在五臺山最高，在蘆芽山最低，且龐泉溝和五臺山之間均有顯著差異(P<0.05)；總碳和總硫含量在所有站點間均差異不顯著。這表明3個研究站點環(huán)境異質性比較高。

圖1 不同研究站點的土壤理化性質Fig.1 Soil physicochemical properties at different sampling sites不同字母表示土壤理化因子在不同的研究站點的差異達到0.05的顯著水平。WT：五臺山葉斗峰；PQG：關帝山龐泉溝自然保護區(qū)；LY：蘆芽山。下同。Different letters mean the significant difference (P>0.05)for soil physicochemical properties at different sites.WT：Yedoufeng of Wutai Mountain；PQG：Pangquangou Nature Reserve of Guandi Mountain；LY：Luya Mountain.The same below.

3.2 細菌群落結構和表型分析

通過高通量測序，總共測得1 062 241個高質量序列，共比對出4 258個OTUs。測序的覆蓋度指數(shù)為95.19%～99.75%，表明所比對的序列涵蓋了絕大部分土壤樣品中的細菌序列。

相對豐度大于0.01%的細菌門總共比對出15個(圖2)。在所有研究站點中，變形菌門(Proteobacteria)(平均相對豐度=30.59%)的相對豐度最高；其次是酸桿菌門(Acidobacteria，19.63%)、放線菌門(Actinobacteria，16.51%)和綠彎菌門(Chloroflexi，13.22%)。其中，變形菌門的相對豐度在龐泉溝最高(34.39%)，放線菌門的相對豐度在蘆芽山最高(26.29%)。酸桿菌門(28.68%)和綠彎菌門(16.09%)的相對豐度在五臺山最高。另外，相對豐度大于0.01%的細菌綱有20個。

圖2 優(yōu)勢細菌門在各研究站點的分布Fig.2 Distribution of dominant bacterial phylum in each site

Bugbase菌群表型預測分析表明，不同站點的菌群表型有很大差異。單因素方差分析(圖3)表明，需氧表型在蘆芽山與五臺山間有顯著差異(P<0.05)，但在蘆芽山和龐泉溝、五臺山與龐泉溝之間無顯著差異(P>0.05)。厭氧表型在蘆芽山與五臺山、龐泉溝與五臺山之間有顯著差異(P<0.05)，而在蘆芽山與龐泉溝之間無顯著差異(P>0.05)。移動元件含量在蘆芽山和五臺山、龐泉溝和五臺山之間均有顯著差異(P<0.05)。生物膜形成在五臺山與龐泉溝間有顯著差異(P<0.05)。另外，革蘭氏陰性、革蘭氏陽性、兼性厭氧、脅迫耐受和致病潛力等表型在不同站點間無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同研究站點的細菌表型的單因素方差分析Fig.3 ANOVA of bacterial phenotype at different sampling sites不同字母表示細菌表型在不同的研究站點間的差異達到0.05的顯著水平。Different letters indicate that the difference in bacterial phenotype between different sampling sites reaches a significant level of 0.05.

非度量多維尺度分析(NMDS)表明，在二維空間上，土壤細菌群落的結構(圖4a)和表型(圖4b)同一站點內的點離得相對較近，而不同站點間的點離得相對較遠，表明群落相異性在同一站點較小，不同站點間較大。進一步通過ANOSIM分析表明，微生物群落的結構和表型在不同站點間差異顯著(P<0.01)。

圖4 不同研究站點細菌群落的非度量多維尺度分析Fig.4 NMDS analysis(Non-metric multidimensional scaling；NMDS)of bacterial community(a)and phenotype(b)at sampling sites不同顏色或形狀的點代表不同分組的樣本，2樣本點越接近，表明2樣本物種組成越相似。橫縱坐標表示相對距離，無實際意義。Stress：檢驗NMDS分析結果的優(yōu)劣。通常認為Stress<0.2時可用，其圖形有一定的解釋意義。Points of different colors or shapes represent samples in different groups.The closer the two sample points are,the more similar the species composition of the two samples.The abscissa and ordinate indicate the relative distance and have no practical meaning.Stress:Test the pros and cons of the NMDS analysis results.It is generally considered that it is available when stress<0.2,and its graphics have a certain explanatory significance.

3.3 環(huán)境因子與土壤細菌群落的結構和表型的關聯(lián)分析

細菌群落結構與土壤理化性質的RDA分析結果(圖5a)表明，土壤的pH值和有機碳、總碳和總氮含量對細菌群落結構的影響顯著(蒙特卡洛置換檢驗，P<0.01)。RDA的2軸總共解釋了88.16%的總變異。其中，變形菌門和藍藻門(Cyanobacteria)等受pH值影響較多，而土壤有機碳，總氮和總碳含量主要影響浮霉菌門(Planctomycetes)。

細菌群落表型與土壤理化性質的RDA分析結果(圖5b)表明，土壤的pH值和有機碳、總碳和總氮含量對細菌群落表型也有顯著影響(蒙特卡洛置換檢驗，P<0.01)。RDA的2軸總共解釋了95.43%的總變異。其中，脅迫耐受、需養(yǎng)、革蘭氏陽性和兼性厭氧等表型受總碳和總氮含量的影響較大，而革蘭氏陰性和治病潛力等表型則受到pH值影響較大，需氧、厭氧和移動元件含量表型受土壤有機碳含量影響較大。

圖5 冗余分析揭示土壤理化性質和土壤細菌群落之間的關系Fig.5 Redundancy analysis(RDA)reveals the relationship between soil physicochemical properties and soil bacterial communities圖中橫縱坐標表示土壤環(huán)境因子對細菌的群落結構(a)或表型(b)的解釋度。圖中箭頭表示環(huán)境因子，箭頭連線的長度表示該環(huán)境因子與細菌的群落結構(a)或表型(b)相關程度的大小，連線越長，相關性越大，反之相關性越小。箭頭的連線與排序軸以及箭頭連線之間的夾角表示相關性，夾角越小相關性越高。銳角表示正相關關系，鈍角表示負相關關系。The horizontal and vertical coordinates in the figure indicate the degree of explanation of the soil environmental factors to the bacterial community structure(a)or phenotype(b).The arrow in the figure indicates the environmental factor,and the length of the arrow line indicates the degree of correlation between the environmental factor and the bacterial community structure(a)or phenotype(b).The longer the line,the greater the correlation,and vice versa..The angle between the line of the arrow and the sort axis and the line of the arrow indicates the correlation.The smaller the angle,the higher the correlation.An acute angle indicates a positive correlation,and an obtuse angle indicates a negative correlation.

3.4 土壤細菌群落和表型對環(huán)境因子的一致性分析

基于細菌群落的結構和表型的主成分分析(PCA)所獲得的2組PCA坐標，進行普魯克分析(圖6)，表明不同站點的細菌物種豐度組成和表型間存在很強的關聯(lián)(M2=0.217 8，且P<0.001)，具有類似的生物地理分布格局，從而進一步推斷細菌群落的結構和表型的空間分布格局具有潛在的一致性，即土壤中細菌群落結構與表型對環(huán)境響應具有一致性。

圖6 細菌群落結構和表型的普魯克分析Fig.6 Procrustes analysis of bacterial species abundance composition and phenotypic plasticity

通過對表型可塑性與環(huán)境因子和相關優(yōu)勢菌群的分析(圖7)表明，土壤總氮含量和酸桿菌門、綠彎菌門極顯著正相關，與需氧表型顯著負相關(P<0.05)，這從另一方面佐證了土壤理化性質與土壤細菌群落的結構和表型具有很強的關聯(lián)，且菌群結構和表型之間表現(xiàn)出比它們與土壤理化性質之間更明顯的相關。

圖7 表型可塑性與環(huán)境因子和優(yōu)勢菌群的相關分析Fig.7 Correlation analysis of phenotypic plasticity with environmental factors and dominant bacterial phylum圖中的*表示顯著水平；在相關分析中，只有呈現(xiàn)顯著的相關關系，才會以線條的形式顯示出來。* in the figure indicates the level of significance;in correlation analysis,only significant correlations will be displayed in the form of lines.

4 討論

本研究中3個站點的土壤pH值和總氮、有機碳、硝態(tài)氮的含量都比較高，表明土壤肥力較好，與前人研究結果類似(喬沙沙等，2017)，可能因華北落葉松林有大量凋落物、土壤深厚、肥沃、濕潤且排水良好(Zhaoetal.，2019a)。本研究中所有站點的變形菌門的相對豐度最高，其次是酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門等，這可能因土壤中變形菌門和擬桿菌門的菌群大多會富集在弱酸性、土壤濕度大、資源有效性高的土壤中，并可以將易分解的碳作為碳源(Zhaoetal.，2019；Pangetal.，2011；李毳等，2018)。

本研究中，與氧需求相關的表型(需氧、厭氧)、生物膜形成和與移動元件含量相關的表型在不同站點間差異顯著，這可有以下幾個原因：

1)與氧需求相關的表型(需氧、厭氧、兼性厭氧)變化可能與土壤鹽度有關(Bronicketal.，2005)。有研究指出，厭氧表型的相對豐度與鹽度呈顯著正相關，而兼性厭氧和生物膜形成表型的相對豐度與鹽度呈顯著負相關(Zhangetal.，2019)。一方面，土壤中較高的鹽分含量可能導致土壤顆粒分散(Roger-Estradeetal.，2009)和結構變化(Wongetal.，2009)，從而迫使微生物產生表型的差異。另一方面，本研究區(qū)中3個站點的土壤pH值和總碳、總氮、有機碳、氨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量差異顯著。在山地環(huán)境下可能形成很多不同的微氣候、微生境。在這種情況下，土壤微生物響應外界脅迫的時候，需消耗更多能量，導致更快的新陳代謝速率，更快的電子交換速率。因此，與氧需求相關的表型和生物膜形成表型、移動元件表型的含量得以大大加強。

2)也可能和研究區(qū)的海拔梯度有關。有研究指出，一些嗜冷細菌、真菌和革蘭氏陰性細菌主要出現(xiàn)在高海拔地區(qū)(Margesinetal.，2009)。本研究中，五臺山站點的樣方的海拔跨度最大，由此推斷五臺山樣地有較大環(huán)境異質性梯度。土壤理化性質分析表明，土壤的pH值和總氮、有機碳，硝態(tài)氮等含量在五臺山最高，由此推斷土壤最肥。而群落表型分析表明，需氧、厭氧、兼性厭氧和生物膜形成等表型在五臺山的豐度也是最高的。也就是說，環(huán)境異質性梯度越大的地方，土壤微生物群落的表型變化越明顯。由此推斷，微生物能通過調整其表型變化，加強其環(huán)境適應性。這可能與2方面有關：一方面微生物能夠調整其在生長、存活、繁殖等方面資源分配的權衡性，最直接的外在表現(xiàn)是微生物群落表型發(fā)生變化；另一方面，生物有機體能通過表型的適應性改變，產生選擇性的性狀或功能變化或反應，以應對環(huán)境的改變。

3)土壤表層的微生物群落在對抗極端環(huán)境過程中可能會形成特有的生存適應能力和群落組成差異。除此之外，林相和地形的差異，可能也會增大土壤表層的含氧量差異，從而迫使微生物群落調整其在生長、存活、繁殖等方面資源分配的權衡性，從而導致菌群與氧需求相關的表型變化。。

本研究表明，土壤細菌的物種豐度組成和表型具有潛在的環(huán)境適應一致性(M2=0.217 8，且P<0.001)。有學者通過普魯克分析指出，在活性污泥中的細菌群落的物種豐度組成和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)豐度組成具有環(huán)境適應的潛在一致性(Zhaoetal.，2019)。這可能是由于細菌群落的優(yōu)勢菌群和表型之間表現(xiàn)出更明顯的相關，這可能是兩者空間分布格局類似的主要原因。由此推斷微生物菌群結構和表型在應對外界環(huán)境變化時表現(xiàn)為協(xié)同變化。

本研究的不足之處是，Bugbase表型分析僅僅是基于OTU數(shù)據(jù)的預測分析，并不能真實反映出菌群全部表型的變化。但是，本研究結果仍可為土壤微生物的表型可塑性研究提供一些理論參考。另外，在以后研究中，對土壤的性狀的異質性分析應加入土壤粒徑、孔隙度等物理性質的分析。

5 結論

在山西省華北落葉松林自然集中分布區(qū)山地的3個站點，土壤理化性質差異顯著，并對土壤細菌群落的結構和表型產生了很大影響，尤其是與氧需求相關的表型(需氧、厭氧)與移動元件含量。土壤細菌群落的優(yōu)勢菌群的物種豐度和表型具有潛在的環(huán)境適應一致性，表現(xiàn)出對環(huán)境因子的協(xié)同變化和相似的生物地理分布格局。這些結果可為研究土壤微生物的表型可塑性、理解物種共存機制等提供更多理論依據(jù)。