陳越渠 劉慶珍 李立梅張 楊韓 姣張永安

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091；2.吉林省林業(yè)科學(xué)研究院 長(zhǎng)春 130033)

楊樹(shù)潰瘍病是我國(guó)楊樹(shù)(Populusspp.)人工林的重要枝干病害，且發(fā)生面積越來(lái)越大，危害越來(lái)越嚴(yán)重。目前，關(guān)于楊樹(shù)潰瘍病的防治除選育抗病品種增強(qiáng)林木抗病能力外，主要采取化學(xué)防治?；瘜W(xué)防治具有一定的防治效果，但是長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥，不僅容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且也會(huì)造成環(huán)境污染(Hoyt,1969)。生防菌對(duì)病原菌有很強(qiáng)的抑制作用，具有?；院统志眯詮?qiáng)的特點(diǎn)，且能夠增強(qiáng)寄主植物的抗性(Zhouetal.,2014;McEvoy,2018)，因此，調(diào)查和篩選能有效抑制楊樹(shù)潰瘍病的生防菌，研制、開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型的生物殺菌劑開(kāi)展生物防治，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

鏈霉菌屬(Streptomyces)是放線菌門(mén)(Actinobacteria)中最大最高等的一屬，該屬菌株能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和纖維素酶等胞外水解酶裂解真菌細(xì)胞壁等多種具有生物活性的物質(zhì)，使病原真菌生長(zhǎng)受到阻礙，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林病害的生物防治(Baharloueietal.,2010;賀建武等,2011;Araetal.,2012;Tanetal.,2015)。研究發(fā)現(xiàn)，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)的胞外代謝產(chǎn)物豐加霉素對(duì)黃瓜立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的菌絲生長(zhǎng)和菌核形成均有明顯抑制作用(于冰等,2011)；長(zhǎng)白山土壤中分離到的可可鏈霉菌(Streptomycescocaoi)182-2 產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物KA08能夠抑制麥角甾醇在細(xì)胞膜上的合成，引發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，可使煙草赤星病菌鏈格孢(Alternariaalternata)的細(xì)胞膜受損、通透性增加，從而導(dǎo)致其菌絲生長(zhǎng)受阻(高芬等,2013)。有些鏈霉菌還能分泌特有的物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，間接提高植物抗病性，如魏曉麗(2013)發(fā)現(xiàn)棉花(Gossypiumspp.)的內(nèi)生拮抗淀粉酶鏈霉菌(S.diastaticussubsp.ardesiacus)在根內(nèi)定殖可促進(jìn)棉花幼苗光合及生長(zhǎng)，其發(fā)酵液不同稀釋濃度均能增強(qiáng)棉花胚根和胚軸生長(zhǎng)；鏈霉菌JD211對(duì)水稻(Oryzasativa)具有較強(qiáng)的促生抗病效果，隨菌劑濃度提高，幼苗內(nèi)生菌含量下降，土壤病原微生物數(shù)量減少，可促使有益真菌、放線菌、原始動(dòng)物、芽胞桿菌屬(Bacillus)和鏈霉菌屬等功能性菌群的生長(zhǎng)；土壤有機(jī)質(zhì)含量增加，礦質(zhì)養(yǎng)分和酶活性提高，有助于改善土壤微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)水稻植株生長(zhǎng)(王世強(qiáng),2014)。綜上可知，鏈霉菌在植物病害的生物防治方面具有很廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。

本研究以楊樹(shù)潰瘍病菌葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)為靶標(biāo)，篩選能有效抑制楊樹(shù)潰瘍病且具有開(kāi)發(fā)潛力的生防菌株，以期為楊樹(shù)潰瘍病的生物防治提供新的生防因子。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物病原菌：楊樹(shù)潰瘍病菌葡萄座腔菌、楊樹(shù)爛皮病菌金黃殼囊孢菌(Cytosporachrysosperma)和云杉立枯病菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，由吉林省林業(yè)科學(xué)研究院森林病理實(shí)驗(yàn)室分離純化并保存；藍(lán)莓潰瘍病菌葡萄座腔菌和藍(lán)莓枯枝病菌小新殼梭孢(Neofusicoccumparvum)，由延安大學(xué)徐成楠副教授饋贈(zèng)；玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、水稻惡苗病菌串株鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、甜瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌、大豆炭疽病菌(Colletotrichumtruncatum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、茄子褐紋病菌(Phomopsisvexans)、瓜果腐霉病菌(Pythiumaphanidermatum)和煙草赤星病菌鏈格孢由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室饋贈(zèng)。

供試土樣：采自吉林省長(zhǎng)白山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)橫山保護(hù)站落葉松林(Larixgmelinii)、池西保護(hù)站云杉林(Piceaasperata)、峰嶺保護(hù)站針闊混交林等地，共計(jì) 18 份。

供試樹(shù)苗：4 年生黃快楊(Populussimonii×P.pyramidalis‘Huangkuai’)扦插苗。

試劑：Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；16S rDNA forward primer(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)reverse prime(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；Taq PCR Master Mix(2×，blue dye)，上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker DL 2000，寶生物工程(大連)有限公司；Granulated agar，BD生物科學(xué)；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：BX53型奧林巴斯光學(xué)顯微鏡；ABI Veriti FAST 梯度PCR儀(美國(guó)ABI公司)；S-3400N型電子掃描顯微鏡(HITACHI公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌株篩選與抑菌活性測(cè)定 采用稀釋分離法分離純化菌株(周德慶,2011)。分離獲得的所有菌株純化 3～5 次后，轉(zhuǎn)入高氏一號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待各菌株產(chǎn)生足量孢子后進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

以楊樹(shù)潰瘍病菌葡萄座腔菌為靶標(biāo)，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗鏈霉菌抑菌活性測(cè)定。將靶標(biāo)株菌制成直徑 5 mm 菌餅接種于培養(yǎng)基正中央，在距離菌餅上下 17.5 mm處用接種環(huán)挑取培養(yǎng) 72 h 的放線菌在玻璃紙上劃線接種，平行劃線間距 35 mm，28 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h后測(cè)量放線菌與病原真菌之間抑菌帶寬，每處理重復(fù) 3 次。根據(jù)抑菌帶大小和穩(wěn)定性獲得目標(biāo)菌株。

1.2.2 生防菌株及其發(fā)酵液抑菌譜測(cè)定 發(fā)酵培養(yǎng)基配方(質(zhì)量體積比)：淀粉 7.0%、花生餅粉 3.3%、(NH4)2SO40.4%、CaCO30.4%、NaCl 0.4%，pH 7.0。種齡 5天，裝樣量 40 mL/250 mL，接菌量為 5 個(gè)直徑 7 mm菌餅，恒溫震蕩培養(yǎng)(28 ℃、150 r·min-1)5天，發(fā)酵液 8 000 r·min-1離心 15 min，上清液過(guò) 45 μm細(xì)菌濾器，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌譜，制備直徑 5 mm的病原菌菌塊，十字交叉等距倒置于PDA平板上，中央放置牛津杯，加樣量 200 μL，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h后，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3 菌株 HS1 發(fā)酵液對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的防治效果 在吉林省林業(yè)有害生物天敵繁育基地楊樹(shù)試驗(yàn)區(qū)，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的 4 年生黃快楊進(jìn)行人工接種防治試驗(yàn)。接種參照冀瑞卿(2007)方法，略有改進(jìn)：用解剖刀在樹(shù)干韌皮部劃2 cm左右傷口，用酒精噴燈灼燒傷口約10 s后，將提前制備好的3個(gè)直徑7 mm菌餅倒置于傷口處，浸無(wú)菌水的脫脂棉纏繞傷口，再用封口膜包扎，使脫脂棉保持溫潤(rùn)狀態(tài)。7天后解除包扎，停止保濕，去除菌餅，大部分樹(shù)干開(kāi)始發(fā)病，繼續(xù)觀察是否出現(xiàn)分生孢子器和分生孢子角。

生物測(cè)定試驗(yàn)采取接種前涂藥處理和接種后涂藥處理2種方式，每種處理方式分為發(fā)酵液上清液、稀釋800倍液多菌靈和未發(fā)酵培養(yǎng)基上清液3組，每組 15 株，3 次重復(fù)。接種前涂藥處理主要檢測(cè)其預(yù)防作用，涂藥 3 次，每次50 mL,間隔 72 h，涂藥位置在接種處上下 20 cm范圍內(nèi)，最后1次涂藥 72 h后接種；接種后涂藥處理主要檢測(cè)其治療作用，接種 72 h后開(kāi)始涂藥，共 3 次，每次50 mL,間隔 72 h，涂藥位置在接種處上下 20 cm范圍內(nèi)；對(duì)照組采用未發(fā)酵培養(yǎng)基上清液，處理方式同上。接種后15天調(diào)查苗木發(fā)病情況，計(jì)算防治效果，公式如下：

病情指數(shù)分級(jí)參考吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)《楊樹(shù)爛皮病綜合治理技術(shù)規(guī)程》，Ⅰ級(jí)(代表值 0)：無(wú)??；Ⅱ級(jí)(代表值 1)：病斑橫向長(zhǎng)度占樹(shù)干周長(zhǎng)的 1/4 以下；Ⅲ級(jí)(代表值 2)：病斑橫向長(zhǎng)度占樹(shù)干周長(zhǎng)的 1/4～2/4 ；Ⅳ級(jí)(代表值 3)：病斑橫向長(zhǎng)度占樹(shù)干周長(zhǎng)的 2/4～3/4 ；Ⅴ級(jí)(代表值 4)：病斑橫向長(zhǎng)度占樹(shù)干周長(zhǎng)的 3/4 以上，樹(shù)木瀕死或死亡。

1.2.4 菌株 HS1 形態(tài)特征觀察 將菌株培養(yǎng)液接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基，涂布涂勻，以滅菌蓋玻片斜插于平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)5天后取出蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征。用掃描電鏡觀察菌株孢子鏈、孢子形態(tài)和表面結(jié)構(gòu)，制片參照楊瑞等(2014)方法。按中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類(lèi)組(1975)的研究方法，將菌株 HS1 轉(zhuǎn)接于各鑒定培養(yǎng)基斜面，15天后觀察并記錄菌株在各鑒定培養(yǎng)基上氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、可溶性色素的顏色和特征。

1.2.5 菌株 HS1 生理生化特性測(cè)定 菌株HS1耐受特性、碳源利用、酶學(xué)特性和代謝產(chǎn)物測(cè)定參照阮繼生等(2011)方法。

1.2.6 菌株 HS1 分子生物學(xué)鑒定 DNA提取按Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。PCR反應(yīng)體系為 50 μL：PCR Mixture 25 μL，Template 2 μL，Primer F1、Primer R1 各 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 30 s，57 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 次循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。以無(wú)菌水的PCR產(chǎn)物為陰性對(duì)照，以實(shí)驗(yàn)室已測(cè)定 16S rDNA菌株的PCR產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照，上樣量2 μL，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。出現(xiàn)符合長(zhǎng)度單一條帶，將PCR產(chǎn)物送至長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司測(cè)序，結(jié)果與EZbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，采用MEGA 6.0 軟件的鄰接法(neighbor-joining，NJ)進(jìn)行序列比對(duì)并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩

通過(guò)調(diào)查、分離和純化，得到104 株放線菌菌株，平板對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑菌帶寬大于10 mm的有 13 株，抑菌帶寬大于 19 mm的有 3 株，其中，菌株HS1 抑菌效果最好，抑菌帶寬達(dá)20.66 mm(表1、圖1)。因此，選擇菌株HS1 開(kāi)展進(jìn)一步研究。

表1 菌株對(duì)楊樹(shù)潰瘍病菌葡萄座腔菌的抑菌活性①Tab.1 Inhibition of strains streptomyces to Botryosphaeria dothidea

圖1 菌株HS1對(duì)楊樹(shù)潰瘍病菌葡萄座腔菌的抑制效果Fig.1 The inhibition effect of strain HS1 to Botryosphaeria dothidea

2.2 菌株HS1 及其發(fā)酵液的抑菌譜

菌株HS1 抑菌譜廣，對(duì)所有供試植物病原菌均有一定抑制作用(表 2)。對(duì)楊樹(shù)潰瘍病菌葡萄座腔菌、楊樹(shù)爛皮病菌金黃殼囊孢菌、藍(lán)莓潰瘍病菌葡萄座腔菌、云杉立枯病菌尖孢鐮刀菌、茄子褐紋病菌和大豆炭疽病菌的抑制作用明顯，平均抑菌帶寬達(dá)20.00 mm以上，與其他病原菌對(duì)比差異顯著(P<0.05)；對(duì)玉米大斑病菌、煙草赤星病菌鏈格孢、甜瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌、辣椒炭疽病菌也有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌帶寬達(dá) 15.00 mm以上。

菌株HS1 發(fā)酵液能夠抑制所有供試植物病原菌生長(zhǎng)(表 2)，對(duì)楊樹(shù)潰瘍病菌葡萄座腔菌、楊樹(shù)爛皮病菌金黃殼囊孢菌、藍(lán)莓潰瘍病菌葡萄座腔菌和玉米大斑病菌的抑菌效果最好，與其他病原菌相比差異顯著(P<0.05)，抑菌直徑達(dá)39.00 mm以上；對(duì)大豆炭疽病菌、茄子褐紋病菌、煙草赤星病菌鏈格孢和辣椒炭疽病菌也具有良好的抑菌作用，抑菌直徑超過(guò) 30.00 mm。

表2 菌株HS1及其發(fā)酵液的抑菌譜①Tab.2 Antimicrobial spectra of antagonistic microorganism and fermented broth about HS1

2.3 菌株HS1發(fā)酵液對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的防治效果

對(duì)照組楊樹(shù)發(fā)病率和病情指數(shù)顯著高于處理組；菌株HS1發(fā)酵液對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的治療和預(yù)防效果均優(yōu)于多菌靈，且差異顯著(P<0.05)(表3)。繼續(xù)觀察 15天，對(duì)照組植株病斑擴(kuò)大，可見(jiàn)明顯的分生孢子器，部分有分生孢子角出現(xiàn)，而發(fā)酵液處理組植株病斑沒(méi)有擴(kuò)大，病斑處罕見(jiàn)分生孢子器，無(wú)分生孢子角出現(xiàn)。

表3 菌株HS1對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的防治效果①Tab.3 Inhibition effect of the strain HS1 against poplar canker

2.4 菌株HS1 的分類(lèi)鑒定

2.4.1 菌株HS1的形態(tài)特征 菌株HS1 在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上呈輻射狀生長(zhǎng)，氣生菌絲茂盛，28 ℃ 培養(yǎng) 1～2天，圓形菌落光滑、無(wú)孢子生成。第 3天開(kāi)始有白色孢子從菌落邊緣長(zhǎng)出，4天后逐漸變?yōu)槿獍霭咨?，基質(zhì)菌絲體呈酪黃色，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生(圖2A)。培養(yǎng) 30天后，菌落凸出變大，呈灰紫粉色(圖2B)。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲細(xì)長(zhǎng)且有大量分枝，菌絲多呈直線形，無(wú)橫膜，不斷裂(圖2C)，孢子可見(jiàn)于菌絲不同位點(diǎn)(圖2D)。掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲飽滿，表面光滑，呈直線形，有的末端略有彎曲，孢子呈圓柱形，大小均一，孢子鏈延伸呈直線形(圖3)。根據(jù)形態(tài)特征，初步判定菌株HS1 為鏈霉菌。

圖2 菌株HS1的菌落(A、B)、菌絲(C)和孢子(D)Fig.2 The morphology of colony(A,B),hyphae(C)and spores(D)of the strain HS1

圖3 菌株HS1的菌絲和孢子電鏡圖像Fig.3 The hyphae and spores of the strain HS1

2.4.2 菌株HS1的培養(yǎng)特征 菌株HS1轉(zhuǎn)接于15種鑒定培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后有菌落出現(xiàn)，72～96 h后開(kāi)始產(chǎn)生孢子。不同培養(yǎng)基上菌苔形態(tài)、孢子堆顏色、基質(zhì)菌絲顏色、產(chǎn)生色素和生長(zhǎng)情況有所不同。菌株HS1在不同培養(yǎng)基上菌絲大部分近白色，基內(nèi)多呈黃色和白色，只在個(gè)別培養(yǎng)基中產(chǎn)生可溶性色素(表4)。綜合菌株在15種鑒定培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征及菌絲和孢子形態(tài)，初步判定菌株HS1為淡紫灰類(lèi)群鏈霉菌。

表4 菌株HS1的培養(yǎng)特征①Tab.4 Cultural characteristic of the strain HS1

2.5 菌株HS1的生理生化特征

菌株HS1在pH 5～12范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，pH=7 時(shí)生長(zhǎng)最旺盛；菌株HS1對(duì)NaCl有較強(qiáng)的耐受性，鹽濃度30%時(shí)豐茂度最好；菌株HS1在4～28 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，但不耐受高溫，對(duì)低溫有較好的耐受性，28 ℃左右最適宜生長(zhǎng)(表5)。

表5 菌株HS1的耐受性Tab.5 Tolerance to pH/temperature/NaCl of the strain HS1

菌株HS1能夠利用D-木糖、D-果糖、葡萄糖、α-乳糖、麥芽糖、鳥(niǎo)嘌呤、甘氨酸、L-酪氨酸和L-阿拉伯糖，其中以D-木糖、D-果糖和葡萄糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)旺盛，但菌株HS1不能利用棉子糖、甘露醇和L-鼠李糖(表6)。菌株HS1過(guò)氧化氫酶、脲酶、淀粉水解試驗(yàn)均為陽(yáng)性，酯酶試驗(yàn)為陰性，不能使明膠液化，不能分解利用纖維素。甲基紅(M-R)試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇(V-P)試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陽(yáng)性(圖4)。

圖4 菌株HS1硝酸鹽還原試驗(yàn)/甲基紅試驗(yàn)/乙酰甲基甲醇試驗(yàn)Fig.4 Nitrate reduction/M-R/V-P test of the strain HS1

表6 菌株HS1的碳源利用Tab.6 Utilization of carbon sources of the strain HS1

2.6 菌株HS1的分子生物學(xué)鑒定

提取菌株HS1基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序(圖5)，得到菌株16S rDNA基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 398 bp(基因登錄號(hào)：MN636764)。與EZbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)鏈霉菌16S rDNA序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株HS1與Streptomycesscopuliridis同源性最高，達(dá)99%。

圖5 HS1基因組DNA和16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis of the genome DNA of the strain HS1 and the genome of 16S rDNA by PCR productsM:DNA Marker DL15000+2000;1:HS1的總DNA;2、5:陽(yáng)性對(duì)照;3、4:HS1 DNA16S rDNA PCR產(chǎn)物;6:陰性對(duì)照.M:DNA Marker DL15000+2000;1:Total DNA of HS1;2,5:Positive control;3,4:PCR products of HS1 DNA16S rDNA;6:Negative control.

圖6 菌株HS1及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 The phylogenetic tree of the strain HS1 and relative strains

3 討論

楊樹(shù)潰瘍病菌葡萄座腔菌寄主廣泛，不僅危害楊樹(shù)，而且還可引起蘋(píng)果輪紋病(孫鑫垚,2010)、藍(lán)莓枝干潰瘍病(康海婷等,2019)、甜櫻桃流膠病(張倩等,2020)、山核桃干腐病(王瓊偉，2019)等多種病害，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，已有一些關(guān)于楊樹(shù)潰瘍病生防菌株的報(bào)道，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(胥麗娜等,2007)、黃綠木霉菌(Trichodermaaureoviride)和木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)(楊蕾等，2015)等，以及葡萄座腔菌引起的蘋(píng)果輪紋病生防菌株篩選的報(bào)道，如婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)(李永麗等,2020)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)(陳欣怡,2016)等，但還均處于室內(nèi)體外抗菌活性測(cè)定試驗(yàn)階段，仍需篩選出更多優(yōu)質(zhì)的生防菌株，系統(tǒng)開(kāi)展發(fā)酵工藝、抗菌機(jī)制、抗菌物質(zhì)鑒定等方面的深入研究，以開(kāi)發(fā)出環(huán)保高效的生物菌劑應(yīng)用于生產(chǎn)。

Farris等(2011)在美國(guó)阿拉巴馬州土壤中分離出鏈霉菌StreptomycesscopuliridisRB72T，其理化性質(zhì)和形態(tài)與菌株HS1有一定相似性。劉若寒(2015)從鏈霉菌Streptomycesscopuliridis發(fā)酵液中分離鑒定出9種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中包括2種新化合物。Li等(2016)也從土壤中分離到Streptomycesscopuliridis，并從發(fā)酵液中分離出2種新型倍半萜。目前，未見(jiàn)鏈霉菌Streptomycesscopuliridis應(yīng)用于植物病害防治的研究。

本研究通過(guò)形態(tài)觀察、菌株理化特性測(cè)定、16S rDNA序列分析等方法對(duì)生防菌株HS1的分類(lèi)地位進(jìn)行探討，但16S rDNA序列比對(duì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株HS1與Streptomycesscopuliridis并非100%同源，目前正在開(kāi)展全基因組測(cè)序，以期通過(guò)更深入的研究明確菌株HS1的分類(lèi)地位。另外，林間防治試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HS1發(fā)酵液對(duì)楊樹(shù)潰瘍病具有良好的防治和治療效果，推測(cè)其代謝產(chǎn)物可能對(duì)楊樹(shù)防御酶體系啟動(dòng)有誘導(dǎo)作用，需開(kāi)展菌株對(duì)楊樹(shù)誘導(dǎo)抗病性機(jī)制方面的研究加以證實(shí)。本研究?jī)H對(duì)菌株HS1的分離鑒定和林間防治效果進(jìn)行了探討，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)菌株為生防制劑或生物肥料應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際需對(duì)其抑菌機(jī)制、代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)分離純化、在植物根際定殖能力以及安全性評(píng)價(jià)等方面開(kāi)展深入研究。

4 結(jié)論

采用稀釋分離法從吉林省長(zhǎng)白山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)橫山保護(hù)站林下土壤樣品中分離得到104株放線菌菌株，以楊樹(shù)潰瘍病菌葡萄座腔菌為靶標(biāo)，運(yùn)用多重篩選法獲得了抑菌效果明顯、抑菌譜廣且效果穩(wěn)定的生防鏈霉菌菌株HS1，通過(guò)形態(tài)學(xué)和生理生化特征分析，初步鑒定該菌株為淡紫灰類(lèi)群鏈霉菌；16S rDNA序列比對(duì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株HS1與Streptomycesscopuliridi同源性最高。人工接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株HS1發(fā)酵液對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的預(yù)防和治療效果分別為60.87%和71.74%。生防菌株HS1可有效預(yù)防和控制楊樹(shù)潰瘍病，且對(duì)多種農(nóng)林重要病害病原菌的抑菌作用效果明顯，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。