李 真 袁婷婷 朱成磊 楊克彬 宋新章 高志民

(1.國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所 國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點實驗室 北京 100102；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 杭州 311300)

在細菌、真菌和植物中發(fā)現(xiàn)700多個AMT同源蛋白(Xuanetal.,2017)。擬南芥AMT分為2個亞家族，其中AMT1亞家族AtAMT1;1、AtAMT1;3和AtAMT1;5編碼的蛋白參與高親和性銨轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，AtAMT1;2編碼的蛋白參與低親和性銨轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，并推測其參與質(zhì)外體途徑運輸(Loqueetal.,2006)。水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等單子葉植物AMT也分為2個亞家族，但其AMT2亞家族成員的數(shù)量遠多于雙子葉植物AMT2亞家族(Guetal.,2013)。水稻OsAMT1;1、OsAMT1;2和OsAMT1;3均在根中表達，OsAMT2;1則在芽中大量表達(Sonodaetal.,2003;Suenagaetal.,2003)。玉米ZmAMT1;1a和ZmAMT1;3b編碼的蛋白在根和葉中表現(xiàn)出高銨轉(zhuǎn)運活性，ZmAMT1;1b則在葉鞘中特異性表達(Dechorgnatetal.,2019)。盡管對擬南芥、水稻和玉米等植物中AMT已有深入研究，但竹子中AMT的研究卻鮮有報道，其對銨態(tài)氮的吸收、運輸?shù)姆肿訖C制尚不清楚。

竹子是世界上生長最快的植物之一，快速生長的特性賦予其具有高效吸收礦質(zhì)元素并快速同化的能力。毛竹(Phyllostachyedulis)是我國原產(chǎn)最具特色的經(jīng)濟竹種，分布廣面積大(467.78萬hm2)，占我國竹林總面積的72.96%(李玉敏等，2019)。在毛竹林爆發(fā)式生長時期，毛竹各器官營養(yǎng)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)快速增加，并在6—7月毛竹快速生長階段完成后達到最高峰，其中氮元素的積累量最高，占營養(yǎng)元素總量的58%(曾瑩瑩等，2015)。另外，毛竹林下土壤氮礦質(zhì)化的氨化比例較高(劉琦蕊，2016)，尤其是生長早期的幼竹對銨態(tài)氮具有偏向吸收性(王興萌等，2019)，因此銨態(tài)氮環(huán)境能滿足毛竹快速生長對氮素的需求，對毛竹快速生鞭擴張、發(fā)筍成林至關(guān)重要。為此，本研究以毛竹為對象，從全基因組水平對其AMT的分子特征進行系統(tǒng)分析，并研究AMT基因在不同組織中以及不同激素和非生物脅迫處理后的表達模式，為深入研究AMT功能、篩選具有育種價值的AMT基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)與處理

將毛竹種子播種于基質(zhì)[泥炭︰蛭石(V/V)=3︰2]中，置于25 ℃的溫室中培養(yǎng)，待實生苗生長至2個月大小，選擇株高和長勢相似的植株用20% PEG-6000溶液進行模擬干旱處理，分別在處理0、3、6、12 h時收集植株根系樣品，液氮處理后保存于-80 ℃，以備用于RNA提取，進行定量PCR(qPCR)分析。

1.2 毛竹AMT的全基因組鑒定

從NCBI下載擬南芥和水稻的AMT氨基酸序列和核苷酸序列(Haoetal.,2020)，在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫BambooGDB(http:∥bamboo.bamboogdb.org/)中進行Blast比對查詢，并用NCBI的CDD工具確定銨轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的準(zhǔn)確性和完整性。利用在線軟件protparam(https:∥web.expasy.org/protparam/)和ProtComp 9.0(http:∥linux1.softberry.com/berry.phtml)進行毛竹AMT蛋白的理化性質(zhì)和亞細胞定位預(yù)測，并利用TMHMM Server v 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Phobius(http:∥phobius.sbc.su.se/)分別對毛竹AMT蛋白進行拓撲結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測。

1.3 毛竹AMT家族成員系統(tǒng)發(fā)育與結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA Ⅹ完成，采用Muscle進行多序列比對，基于p-distance模型采用鄰接法(neighbor-joining method)生成系統(tǒng)進化樹，對gap和缺失的序列選擇成對比對刪除(pairwise deletion)，bootstrap設(shè)置為1 000；通過GSDS(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行基因結(jié)構(gòu)分析，選擇轉(zhuǎn)錄本上游2 kb的序列作為啟動子序列，從PlanCARE數(shù)據(jù)庫查找順式作用元件；利用MEME V5.1.1(http:∥meme-suite.org/)進行保守基序分析，并用TBtools(Chenetal.,2020)進行可視化處理。

1.4 毛竹AMT基因的表達分析

依據(jù)本實驗室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Zhaoetal.,2018)構(gòu)建毛竹AMT基因的組織表達譜，以Log2(FPKM)的值進行表達量熱圖繪制。通過文獻從NCBI Short Read Archive(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)獲取毛竹不同激素和非生物脅迫處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括2個月毛竹幼苗全株經(jīng)100 μmol·L-1赤霉素(GA3)溶液處理4 h(SRR6131113-SRR6131118)(Zhangetal.,2018)，1個月毛竹幼苗全株經(jīng)5 μmol·L-1生長素(NAA)處理4 h(SRS2294012-SRS2294017)(Wangetal.,2017)，18天毛竹幼苗經(jīng)10 μmol·L-1油菜素內(nèi)酯合成抑制劑(propiconazole，PPZ)處理5天后再用1 μmol·L-1油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BL)處理4 h的根(SRS4136433-SRS4136450)(Zhangetal.,2020)，2年生毛竹實生苗經(jīng)低溫和干旱處理2 h的葉片(SRS1759772)(Huangetal.,2016)。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲取PeAMTs的表達量數(shù)據(jù)，以Log2(FPKM)的值進行表達量熱圖繪制，選擇單因素方差分析中表達差異顯著(P<0.05)的基因，采用Log2(FPKM+1)計算基因表達量并繪制折線圖。

根據(jù)毛竹AMT基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異定量引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。用于qPCR分析的cDNA源自1.1中干旱處理不同時間的毛竹根系，通過TRIzol(Invitrogen)法從中提取RNA，用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。qPCR試驗在qTOWER2.2系統(tǒng)上進行，體系參照Roche Light Cycler?480 SYBR Green 1 Master kit試劑盒，程序為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃解鏈10 s，40個循環(huán)。選擇PeNTB作為內(nèi)參基因(Fanetal.,2013)，相對表達量的數(shù)據(jù)處理用2-ΔΔCt法(Livaketal.,2001)。

表1 qPCR所用引物Tab.1 Primers used in qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹AMT家族基因的鑒定與基因結(jié)構(gòu)分析

在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫BambooGDB鑒定出13個基因編碼完整的AMT蛋白，命名為PeAMT1-PeAMT13。PeAMTs的編碼區(qū)長度為1 224～1 491 bp，編碼蛋白長度為408～497個氨基酸(aa)，分子量(molecular weight,MW)為52.25～53.08 kDa，理論等電點(pI)介于6.58～8.86之間，亞細胞定位預(yù)測均位于質(zhì)膜上。拓撲結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，PeAMTs編碼蛋白屬于跨膜蛋白，除PeAMT13有9個跨膜區(qū)(transmembrane,TM)外，其余成員均有11個跨膜區(qū)。此外，PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3的N端均具有信號肽(signal peptide,SP)(表2)。

表2 PeAMTs編碼蛋白的基本特征Tab.2 Basic characteristics of the proteins encoded by PeAMTs

對PeAMTs上游啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，其中包含多種作用元件，如MYB、MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件，赤霉素、生長素、茉莉酸和脫落酸等激素響應(yīng)元件以及干旱、低溫和缺氧等非生物脅迫響應(yīng)元件(圖1A)。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3不含內(nèi)含子；PeAMT4和PeAMT5含有1個內(nèi)含子；PeAMT6-PeAMT12均含有2個內(nèi)含子，但內(nèi)含子長度差異較大；PeAMT13內(nèi)含子最多(3個)(圖1B)。

圖1 PeAMTs啟動子(A)和基因結(jié)構(gòu)(B)分析Fig.1 Promoter(A)and gene structure(B)analysis of PeAMTs

2.2 PeAMTs的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了分析不同物種之間AMT的進化關(guān)系，對PeAMTs的潛在功能做出合理推測，構(gòu)建了基于毛竹、水稻、玉米、擬南芥和番茄(Lycopersiconesculentum)AMT蛋白氨基酸序列(Haoetal.,2020)的系統(tǒng)進化樹(圖2A)。結(jié)果表明，AMT成員分成了AMT1和AMT2兩個亞家族，雙子葉植物AMTs主要分布在AMT1亞家族中，單子葉植物AMTs主要分布在AMT2亞家族中，其中毛竹與水稻的AMT同源性最高，其次是玉米。PeAMTs屬于AMT2亞家族的成員有10個，而AMT1亞家族中僅有3個成員。AMT2亞家族又聚類為3個組，僅AMT2a組中有雙子葉植物AMT成員，該組包括3個PeAMTs，大部分PeAMTs成員(6個)屬于AMT2b組，AMT2c組僅有PeAMT4一個毛竹成員。

為解析PeAMTs的基因進化情況，將PeAMTs定位到scaffold上并與水稻基因組進行共線性分析(圖2B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)13個PeAMTs分布在11個scaffold上，其中10個基因組成8個共線性基因?qū)?，同屬于AMT1亞家族的PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3，以及同屬于AMT2a組的PeAMT8、PeAMT11和PeAMT12分別彼此呈現(xiàn)共線性，而PeAMT4、PeAMT5和PeAMT6不具有共線性基因?qū)?。對毛竹共線性基因?qū)M行Ka/Ks(非同義替換率/同義替換率)分析，發(fā)現(xiàn)全部Ka/Ks均小于1，說明毛竹AMT家族基因在進化上的保守性，全部經(jīng)歷了純化選擇。另外，有11個PeAMTs與8個OsAMTs之間存在共線性，包括AMT1亞家族的PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3與OsAMT1;1和OsAMT1;2，AMT2a組的PeAMT8、PeAMT11和PeAMT12與OsAMT2;1和OsAMT2;2，這2個分支的OsAMTs分別為根部表達的銨誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)運體(Sonodaetal.,2003)和根芽組成型表達轉(zhuǎn)運體(Suenagaetal.,2003)。具有共線性的PeAMTs數(shù)量多于OsAMTs數(shù)量，推測與毛竹進化過程中發(fā)生過基因組加倍事件有關(guān)，PeAMTs數(shù)量增加可能是毛竹為提高環(huán)境適應(yīng)能力和快速生長需求而形成的。

圖2 AMT家族成員的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogeny analysis of AMT family membersA：基于AMT氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，包括毛竹(Pe)、水稻(Os)、玉米(Zm)、擬南芥(At)、番茄(Le)的AMT氨基酸序列；B：毛竹與水稻的AMT家族基因共線性分析。A:Phylogenetic tree constructed by using the amino acid sequences of AMTs from Phyllostachys edulis (Pe),Oryza sativa (Os),Zea mays (Zm),Arabidopsis thaliana (At)and Lycopersicon esculentum (Le);B:Collinearity analysis of AMT family genes between Phyllostachys edulis and Oryza sativa.

2.3 PeAMTs蛋白保守基序分析

為深入了解PeAMTs蛋白序列的結(jié)構(gòu)特性，對其氨基酸序列進行保守基序分析，共獲得12個保守基序(圖3A)。其中Motif 1-Motif 5和Motif 9是PeAMTs共有的基序，AMT1亞家族成員特有的基序為Motif 6和Motif 12，AMT2亞家族成員特有的基序為Motif 7、Motif 8、Motif 10和Motif 11。Motif 6位于PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3蛋白序列的N端，與其信號肽序列位置一致，推測Motif 6與AMT的轉(zhuǎn)移和定位有關(guān)。PeAMTs共有的Motif 2中包含了AMT典型保守序列D-[FYWS]-[AS]-G-[GSC]-x(2)-[IV]-x(3)-[SAG](2)-x(2)-[SAG]-[LIVMF]-x(3)-[LIVMFYWA](2)-x-[GK]-x-R(Khademietal.,2004)，但AMT2b的4個PeAMTs存在單個氨基酸差異，其中PeAMT6、PeAMT7和PeAMT9保守基序中第3位的絲氨酸(S)變?yōu)榕c其結(jié)構(gòu)相似的半胱氨酸(C)，PeAMT13保守基序最后一位則由賴氨酸(K)代替了原來的精氨酸(R)(圖3B)，這些差異可能是進化過程中堿基突變造成的，個別氨基酸的變化可能是導(dǎo)致其功能差異的重要原因之一。

圖3 PeAMTs保守基序分析Fig.3 Conserved motifs analysis of PeAMTsA：PeAMTs保守基序的分布；B：不同PeAMTs中Motif 2的氨基酸序列。A:Distribution of conserved motifs;B:Amino acid sequences of Motif 2 in different PeAMTs.

2.4 PeAMTs的組織特異性表達

基因的組織特異性表達一定程度上能反映該基因發(fā)揮作用的位置，基于毛竹26個組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了13個PeAMTs在其中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各PeAMTs成員的表達模式存在著一定的差異，總體來講PeAMTs在根部的表達水平均較高，但在芽中的表達水平均較低；發(fā)育初期筍中PeAMTs表達水平高于發(fā)育后期筍；葉和籜片中PeAMTs表達水平較高(圖4)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，AMT1亞家族和AMT2a組成員的表達水平高于其他成員，其中AMT1亞家族成員更傾向于在根中高表達，AMT2a組成員更傾向于在葉片中高表達且在生長初期筍中也有一定程度表達，這與同分支OsAMTs的組織表達特性相似(Suenagaetal.,2003;Sonodaetal.,2003)；AMT2b組的PeAMT6和PeAMT7在籜片中高表達，PeAMT9則表現(xiàn)出根部表達的傾向。PeAMTs在不同組織的表達差異，反映了不同PeAMTs在毛竹生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能存在一定的差異，推測PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3主要參與根部的銨轉(zhuǎn)運活動，PeAMT8、PeAMT11和PeAMT12主要參與葉片和發(fā)育初期筍的銨轉(zhuǎn)運活動，它們在毛竹快速生長過程中對銨鹽的獲取和轉(zhuǎn)移可能發(fā)揮著重要作用。

圖4 PeAMTs在毛竹不同組織中的表達分析Fig.4 Expression analysis of PeAMTs in different tissues of Moso bamboo

2.5 PeAMTs對激素處理和非生物脅迫的應(yīng)答

啟動子順式作用元件分析表明，PeAMTs可能響應(yīng)激素和非生物脅迫的誘導(dǎo)。為明確PeAMTs在不同激素和非生物脅迫處理下的表達變化，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對PeAMTs進行了表達分析。結(jié)果表明，經(jīng)GA3處理4 h后，除PeAMT13外的12個PeAMTs的表達呈現(xiàn)顯著變化(P<0.05)，其中PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3的表達水平遠高于其他成員；大部分PeAMTs在GA3處理后表達上調(diào)，而PeAMT1、PeAMT10和PeAMT12的表達顯著下調(diào)(圖5A)。經(jīng)NAA處理4 h后，有6個PeAMTs的表達出現(xiàn)顯著變化(P<0.05)，其中PeAMT4顯著下調(diào)，其他成員顯著上調(diào)(圖5B)。經(jīng)油菜素內(nèi)酯合成抑制劑(PPZ)處理5天后，PeAMT1的表達顯著上調(diào)，PeAMT9和PeAMT10的表達顯著下調(diào)(P<0.05)，隨后經(jīng)油菜素內(nèi)酯處理4 h，大多數(shù)PeAMTs的表達恢復(fù)到PPZ處理前相似的水平(圖5C)。這些結(jié)果表明，PeAMTs受多種激素的誘導(dǎo)，但不同PeAMTs對不同激素的響應(yīng)存在差異。

經(jīng)2 h的低溫脅迫處理后，有6個PeAMTs的表達水平呈現(xiàn)顯著變化，其中PeAMT5、PeAMT11和PeAMT12的上調(diào)達到極顯著水平(P<0.01)，PeAMT2是唯一顯著下調(diào)的成員(P<0.05)；低溫脅迫下，PeAMT11和PeAMT12的表達水平最高，其次是PeAMT3、PeAMT5和PeAMT2，其他成員均呈低水平表達(圖5D)。干旱處理2 h后，有8個PeAMTs的表達水平呈現(xiàn)顯著變化，其中PeAMT10顯著下調(diào)，其他成員均上調(diào)(P<0.05)；干旱處理下PeAMT2和PeAMT3的表達水平最高，其次是PeAMT7、PeAMT11和PeAMT12(圖5E)。PeAMTs在不同非生物脅迫中的表達變化差異，表明其在逆境中將發(fā)揮不同的作用。

圖5 不同處理前后PeAMTs在毛竹中的表達分析Fig.5 Expression analysis of PeAMTs in Moso bamboo under different treatmentsA：GA3處理幼苗；B：NAA處理幼苗；C：油菜素內(nèi)酯合成抑制劑——丙環(huán)唑(PPZ)和油菜素內(nèi)酯(BL)處理幼苗的根；D：低溫處理葉片；E：干旱處理葉片。A:Young seedlings treated with GA3;B:Young seedlings treated with NAA;C:Roots of young seedlings treated with propiconazole(PPZ)and brassinolide(BL);D:Leaves treated with cold;E:Leaves treated with drought.

2.6 關(guān)鍵PeAMTs在干旱處理下的表達模式

結(jié)合其他物種已鑒定AMT成員的銨轉(zhuǎn)運特性和PeAMTs的組織表達特性分析發(fā)現(xiàn)，PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3傾向在根中表達，且在不同激素和非生物脅迫處理下均表現(xiàn)為較高表達豐度，因此認(rèn)為這3個基因可能在毛竹根系吸收銨態(tài)氮過程中具有重要作用。在不同梯度的模擬干旱處理下，毛竹根中基因定量分析結(jié)果顯示，PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3的表達均受到誘導(dǎo)，其中PeAMT1和PeAMT2的表達隨著處理時間增加呈先上升再下降的變化，而PeAMT3則表現(xiàn)為持續(xù)上升趨勢(圖6)。在處理3 h后，PeAMT1表達迅速上調(diào)達到峰值，約是處理前的3.35倍，隨后開始緩慢下調(diào)，12 h后的表達仍高于處理前水平(圖6A)；PeAMT2的表達在處理6 h后達到峰值，約是處理前的3.85倍，在12 h時的表達仍維持較高水平(圖6B)；PeAMT3的表達持續(xù)上升，在處理12 h后達到最高，是處理前的23.34倍(圖6C)。因此，認(rèn)為毛竹中這3個基因?qū)Ω珊稻^為敏感，在干旱處理后能迅速響應(yīng)。

圖6 干旱處理下關(guān)鍵PeAMTs在毛竹根中的表達分析Fig.6 Expression analysis of key PeAMTs in roots of Moso bamboo under drought treatment不同小寫字母表示表達水平差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference of expression level(P<0.05).

3 討論

PeAMTs在進化中發(fā)生了基因加倍。通過對毛竹AMT家族的全基因組分析，鑒定出13個PeAMTs，其中3個成員屬于AMT1亞家族，10個成員屬于AMT2亞家族(圖2A)。AMT1亞家族和AMT2亞家族之間的成員數(shù)量在不同物種中的差異較大。單子葉植物中，AMT2亞家族成員顯著多于AMT1亞家族成員(Suenagaetal.,2003;Guetal.,2013)，雙子葉植物中，AMT1亞家族成員較多或2個亞家族成員數(shù)量相似(Ninnemannetal.,1994;Santosetal.,2017)。2個亞家族在單子葉植物和雙子葉植物之間的數(shù)量差異，意味著2個亞家族在單子葉和雙子葉植物分化后，分別發(fā)生了不同的基因加倍事件(Von Wittgensteinetal.,2014)。共線性分析發(fā)現(xiàn)，部分PeAMTs存在3個旁系同源基因相互共線的現(xiàn)象，共線性基因PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3在毛竹根部高表達，共線性基因PeAMT8、PeAMT11和PeAMT12在毛竹葉片中高表達(圖4)，而毛竹在700萬～1 200萬年前經(jīng)歷過全基因組加倍事件(Pengetal.,2013)，因此這些PeAMTs很可能是為了適應(yīng)快速生長過程中的銨鹽獲取而發(fā)生加倍。

PeAMTs的結(jié)構(gòu)影響其生物學(xué)功能。對PeAMTs編碼蛋白的保守基序分析證明了進化分支的可靠性，同一亞家族的成員共享多個保守基序，不同亞家族成員具有其特有的保守基序，特有保守基序可能決定了PeAMTs的功能特性。保守基序Motif 2中包含了銨轉(zhuǎn)運蛋白的典型序列(圖3B)，該序列在植物中廣泛存在，在大腸桿菌中被認(rèn)為是轉(zhuǎn)運銨態(tài)氮的關(guān)鍵基序，可能涉及銨離子通道的打開與閉合(Khademietal.,2004)。在PeAMTs啟動子上發(fā)現(xiàn)了大量MYB和MYC結(jié)合元件，表明轉(zhuǎn)錄調(diào)控在毛竹N吸收同化的過程中具有重要作用。OsIDD10編碼的轉(zhuǎn)錄因子能與OsAMT1;2啟動子結(jié)合激活其表達，但在OsIDD10敲除突變體中，OsAMT1;2的轉(zhuǎn)錄依然存在，表明了其他轉(zhuǎn)錄因子對OsAMT1;2的調(diào)控作用(Xuanetal.,2013)。研究表明紅藻(Cyanidioschyzonmerolae)CmMYB1與CmAMT存在共表達(Imamuraetal.,2009)，歐洲赤松(Pinussylvestris)PtMYB1和PtMYB4能與氮同化相關(guān)的基因互作(Gomez-Maldonadoetal.,2004)，但毛竹中MYB轉(zhuǎn)錄因子與AMT表達的關(guān)系仍有待研究。

PeAMTs的表達具有組織特異性并受激素和環(huán)境因子的影響?；诿癫煌M織的轉(zhuǎn)錄表達譜分析表明，PeAMTs具有明顯的組織表達特異性，多數(shù)PeAMTs呈現(xiàn)根和葉中表達的傾向，與水稻和擬南芥等植物中AMT基因的表達模式相似(Sonodaetal.,2003;Suenagaetal.,2003;Loqueetal.,2006)，說明PeAMTs在根部銨鹽吸收、葉片銨鹽運輸以及根到筍的銨鹽運輸過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，番茄葉片中LeAMT1;2和LeAMT1;3的表達在晝夜間表現(xiàn)出相反的變化，表明其在光呼吸過程中發(fā)揮著不同的作用(Von Wirenetal.,2000)，這為解釋PeAMTs的功能提供了參考依據(jù)。非生物脅迫和外源激素是影響AMT基因表達的重要因素。干旱脅迫下楸子(Malusprunifolia)MpAMT1;2和MpAMT4;2的表達上調(diào)，認(rèn)為銨態(tài)氮可能在改善楸子抗旱性中發(fā)揮重要作用(Huangetal.,2018)；過表達星星草(Puccinelliatenuiflora)PutAMT1;1增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥對甲基銨的敏感性(Buetal.,2019)；ABA和MeJ處理均能使杜梨(Pyrusbetulaefolia)PbAMT1;5的表達上調(diào)(Lietal.,2016)，但其他激素影響AMT基因表達的研究卻鮮有報道。本研究表明，PeAMTs對激素和非生物脅迫信號的響應(yīng)存在著一定的差異(圖5)，其中PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3對干旱脅迫均具有敏感性(圖6)。

另外，環(huán)境供氮水平影響AMT基因表達和植物生長。研究表明，氮供應(yīng)通過影響銨態(tài)氮下游同化產(chǎn)物谷氨酰胺的含量來調(diào)控AMT基因的表達，但氮饑餓與氮添加對不同AMT基因的誘導(dǎo)存在差異。如氮饑餓后玉米根部ZmAMT1.1A下調(diào)，ZmAMT2.1和ZmAMT3.2上調(diào)，但重新添加氮源后，ZmAMT1.1A和ZmAMT3.2恢復(fù)到對照水平，而ZmAMT2.1依然維持較高水平表達(Dechorgnatetal.,2019)；銨鹽濃度升高會導(dǎo)致小麥(Triticumaestivum)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性癥狀，生物量積累顯著下降，氮饑餓以及向饑餓小麥幼苗再供應(yīng)銨均能觸發(fā)TaAMT1s表達的增加，而硝酸鹽的存在則抑制了它們的表達(Ijatoetal.,2020)；地錢(Marchantiapolymorpha)MpAMT1;2也在缺氮條件下表達上調(diào)，這與AMT基因?qū)Φ挠H和性有關(guān)(Guoetal.,2018)；高銨濃度下AtAMTs能通過主動運輸將銨離子從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞外，發(fā)揮解毒功能(Loqueetal.,2007)；過量表達PbAMT1;5顯著增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥的生物量(Buetal.,2019)，說明AMT通過銨轉(zhuǎn)運影響植物生長。因此，PeAMTs對不同氮水平的響應(yīng)模式有待進一步證實。

4 結(jié)論

本研究從毛竹全基因組中鑒定出13個PeAMTs，它們分別屬于2個亞家族，不同亞家族含有特異的保守基序，可能具有不同的銨轉(zhuǎn)運特性。多數(shù)PeAMTs在根部和葉片中呈現(xiàn)高表達，這與毛竹快速生長過程中需要從土壤中吸收大量的氮素并運輸?shù)饺~片中同化相一致。PeAMTs的表達受多種激素和非生物脅迫的影響，其中GA3、BL和干旱能引起大多數(shù)PeAMTs表達的顯著變化，尤其是PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3受干旱誘導(dǎo)，可能在毛竹抗旱和銨解毒中發(fā)揮著重要作用。本研究為解析PeAMTs在毛竹快速生長過程中的氮轉(zhuǎn)運機制，以及逆境脅迫中毛竹的自我保護和銨解毒機制提供了重要參考依據(jù)。