葉天文 袁德義 李艷民 肖詩鑫 龔守富 張 健 李素芳 羅 健

(1.中南林業(yè)科技大學 經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室 長沙 410004； 2.信陽農(nóng)林學院 信陽 464000；3.海南澄邁樂香種苗管理有限公司 澄邁 571900)

海南油茶(CamelliahainanicaYL Zhao et ZG Xu,sp.nov.)屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)，是2020年在海南省發(fā)現(xiàn)的油茶組(CamelliaSect.Oleifera)新物種(Xuetal.,2020)。根據(jù)作者目前的調(diào)查，海南油茶主要分布于海南省澄邁縣、瓊中縣和屯昌縣等地，常見于當?shù)卮迩f附近或者常綠闊葉林的邊緣地帶，其中不乏有許多大樹、古樹。海南油茶被當?shù)厝朔Q為“山柚”，具有果大、產(chǎn)量高、茶油品質(zhì)佳等優(yōu)良性狀(袁軍等，2014；王碧芳，2016；龔倩穎，2018)，在海南省有著悠久的種植歷史，海南茶油市場價可達600～700元·kg-1，近年來也越來越受到種植戶和消費者的青睞(海南省林業(yè)廳，2018)。此前對于海南油茶的分類問題一直爭議較大，前人研究推斷海南省的本地油茶屬于越南油茶(Camelliadrupifera)、普通油茶(C.oleifera)、小果油茶(Camelliaoleiferavar.monosperma)或者是這些油茶的自然雜交種(王興勝等，2010；鄭道君等，2016)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，海南本地油茶在形態(tài)、茶油品質(zhì)和孢粉學特征等方面與越南油茶、普通油茶等有較大差異(袁軍等，2014；王碧芳，2016；龔倩穎，2018)。進一步通過分子標記技術分析海南本地油茶的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構，發(fā)現(xiàn)與其他省份油茶的遺傳距離較遠(彭方仁等，2012；陳宣等，2019)。而Xu等(2020)從植物分類角度，對比分析了海南本地油茶與越南油茶、紅皮糙果茶(Camelliacrapnelliana)在形態(tài)學、孢粉學上的差異，并利用海南本地油茶與油茶組近緣種的完整葉綠體基因組序列和DNA條形碼基因matK進行系統(tǒng)發(fā)育定位，確認了海南省本地油茶為油茶組的一個新物種。

在自然界中植物多倍化比較普遍，染色體多倍化是推動物種進化、物種形成的重要途徑之一，是物種適應生境的策略(Tateetal.，2009；Triplettetal.，2014)，同時倍性育種也是培育植物新品種、新種質(zhì)的重要手段之一。前人研究(李光濤等，1990；Guetal.，1988)認為山茶屬植物野生種多為二倍體，而在人工馴化和人工選擇的影響下，栽培種和雜交種倍性變異較大，多為四倍體、六倍體和八倍體，且多為異源多倍體，普遍花大、果實大。而油茶組和短柱茶組(CamelliaSect.Paracamellia)是山茶屬中多倍體類群最多的(張文駒等，1999)，其中大花窄葉油茶(狹葉油茶)(Camelliafluviatilisvar.megalantha)為二倍體(閆蕊等，2018)，小果油茶為四倍體(莊瑞林，2008)，普通油茶主要為六倍體(Kondo，1977；莊瑞林，2008)，越南油茶主要為八倍體(莫澤乾，1990)。而海南油茶的倍性尚不清楚。

明確海南油茶的倍性是其種質(zhì)資源評價的重要內(nèi)容，也是開發(fā)利用的重要依據(jù)，因此研究海南油茶的倍性十分重要。首先，油茶是多年生自交不親和植物(高超等，2015)，不同倍性的油茶之間授粉親和性可能不同，且不同倍性油茶之間雜交，油茶單果質(zhì)量、產(chǎn)量和品質(zhì)都可能會出現(xiàn)不同變異情況，所以明確海南油茶的倍性，在生產(chǎn)栽培上將有利于指導授粉樹配置。其次，油茶目前仍然存在產(chǎn)量低、缺乏良種的困境，通過優(yōu)良無性系選育的新品種(系)也存在適應范圍較小、優(yōu)良性狀單一等問題，因此雜交育種是油茶育種的重要途徑，而在雜交親本選配時，親本之間的性狀互補、親和性和可育性是關鍵的考量因素，因此選擇合適的倍性對于油茶雜交育種也至關重要。鑒于此，本研究將采用流式細胞術結(jié)合染色體計數(shù)法對海南油茶的倍性進行研究，以期為海南油茶的授粉樹配置、雜交育種提供便利，為油茶多倍體的遺傳變異和進化機制等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從海南省調(diào)查的海南油茶大樹、古樹中選取60株優(yōu)樹，于2018—2019年采集穗條在海南省澄邁樂香種苗管理有限公司進行扦插繁育，待成活后將幼苗移栽在中南林業(yè)科技大學種質(zhì)資源圃中(表1)，其中包括澄邁縣23份、定安縣3份、瓊中縣21份和屯昌縣13份。采用已知為二倍體的大花窄葉油茶作為對照。大花窄葉油茶從浙江省金華市的國際山茶物種園采集穗條，同樣扦插育苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 流式細胞術 采集海南油茶嫩葉，放入冰盒帶回實驗室待用，所用細胞裂解液(Precise-P,Sysmex)、DAPI染色液(Precise-P,Sysmex)也放入冰盒中預冷。樣品制備：用新的雙面刀片切取大約0.5 cm2待測嫩葉放入一次性培養(yǎng)皿中，加入300 μL解離液，再加入10 μL 質(zhì)量分數(shù)為28.57%的PVP(Polyvinyl Pyrrolidone，Solarbio)水溶液，然后用雙面刀片快速切碎樣品，用50 μm尼龍過濾器過濾到上樣管中，在濾液中立即加入1 000 μL染色液PI，室溫下黑暗靜置5 min，然后用流式細胞儀(Sysmex，Germany)檢測5 000～10 000個細胞，記錄每個樣品DNA含量峰值及變異系數(shù)(CV，%)，樣品倍性分析圖像由Flomax軟件(Sysmex，Germany)生成。參照許蕾等(2019)的外標法，以確定倍性的二倍體大花窄葉油茶作為參照，根據(jù)峰值曲線判斷待測樣品倍性。

續(xù)表1 Continued

1.2.2 染色體計數(shù) 根據(jù)流式細胞術鑒定的結(jié)果，對大花窄葉油茶和34份不同地區(qū)不同倍性的海南油茶代表材料，于晴天上午采集生長旺盛的幼嫩根尖，參照改良的油茶染色體制片技術(葉天文等，2020)進行根尖染色體制片，使用顯微鏡(Olympus BX-61，Japan)觀察拍照，采用Adobe Photoshop2020的分析計數(shù)功能對中期分裂相染色體進行數(shù)量統(tǒng)計，每份材料統(tǒng)計30個分裂相完整的細胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細胞術檢測結(jié)果

本研究供試海南油茶共60份，通過流式細胞儀對其倍性進行檢測，檢測的DNA相對含量峰值、變異系數(shù)(CV，%)和估計的倍性如表2所示：對照二倍體大花窄葉油茶的峰值為50.39，60份海南油茶中，8份峰值范圍是205.50～213.42，與對照的峰值相比為八倍體，50份峰值范圍是243.16～256.11，與對照的峰值相比為十倍體，另外CMZX-612和TCXYL-61峰值分別是177.09和188.02，與對照的峰值相比疑似為七倍體；同時各樣品峰值的變異系數(shù)(CV)大部分都在5%以內(nèi)，說明該檢測結(jié)果較為準確。不同倍性流式細胞術檢測結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同倍性油茶的流式細胞術檢測結(jié)果Fig.1 The flow cytometry peak of different ploidy Camelliaa:對照二倍體(大花窄葉油茶)；b,c,d:海南油茶(b.疑似七倍體；c:八倍體；d:十倍體)。a:Diploid used as control (C. fluviatilis var.megalantha)；b,c,d:C. hainanica(b:Suspected heptaploid；c:Octoploid；d:Decaploid).

表2 海南油茶的DNA含量峰值及倍性估計①Tab.2 The DNA content and ploidy estimation of samples of Camellia hainanica

2.2 染色體計數(shù)結(jié)果

對二倍體大花窄葉油茶和不同地區(qū)海南油茶進行根尖染色體制片，結(jié)果(圖2、表3)表明：二倍體大花窄葉油茶染色體數(shù)為2n=2x=30(圖2-1)，供試的34份海南油茶優(yōu)株中，8份材料為八倍體(2n=8x=120)，其中流式細胞術估測疑似為七倍體的CMZX-612(圖2-7)和TCXYL-61(圖2-9)，經(jīng)根尖細胞染色體計數(shù)(2n=120)確認實際也為八倍體；26份材料為十倍體(2n=10x=150)，其染色體計數(shù)結(jié)果與流式細胞術估測結(jié)果一致。說明流式細胞術檢測結(jié)果與染色體計數(shù)結(jié)果基本一致，但仍有極少數(shù)材料的流式細胞術檢測結(jié)果存在一定偏差。

表3 部分海南油茶的染色體數(shù)目①Tab.3 Chromosome number of some samples of C. hainanica

圖2 海南油茶染色體數(shù)目Fig.2 Chromosome number of C. hainanica標尺 Bar:5 μm.1:二倍體(2n=30)大花窄葉油茶;2-9:八倍體(2n=120)海南油茶;10-35:十倍體(2n=150)海南油茶。詳見表3。1:Diploid(2n=30)of C. fluviatilis var.megalantha;2-9:Octoploid(2n =120)of C. hainanica;10-35:Decaploid(2n =150)of C. hainanica;as shown in Tab.3.

3 討論

目前對于油茶倍性的研究多采用形態(tài)學鑒定法和流式細胞儀鑒定法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相比于二倍體大花窄葉油茶、四倍體小果油茶、六倍體普通油茶和六倍體的長瓣短柱茶(Camelliagrijsii)等，海南油茶在葉面積、花徑、氣孔大小和花粉大小等方面都顯著大于其他油茶，這與賈文慶(2015)對山茶屬植物表型性狀與倍性相關性的研究結(jié)論相符，也說明了海南油茶與其他油茶的倍性存在差異，但是形態(tài)學鑒定無法知道海南油茶的確切倍性。而染色體計數(shù)法精準可靠，特別是對于非整倍體材料和未知的新物種而言，染色體計數(shù)結(jié)果不容易產(chǎn)生爭議性，這對于鑒定海南油茶倍性很關鍵。

流式細胞術是近年來發(fā)展的一種快速便捷的檢測方法，已在獼猴桃(Actinidia)(施春暉等，2014)、柑橘(Citrus)(張俊娥等，2003)、杉木(Cunninghamialanceolata)(丁國昌等，2013)和橡膠樹(Heveabrasiliensis)(張源源等，2020)等諸多果樹林木的倍性檢測中發(fā)揮重要作用，龔倩穎(2018)、賈文慶(2015)、徐曉丹等(2018)也利用流式細胞儀對油茶及其他山茶屬植物進行倍性檢測，結(jié)果較為理想。但研究發(fā)現(xiàn)，油茶本身產(chǎn)生的一些次生代謝物嚴重影響了流式細胞術檢測結(jié)果的準確性，同一份材料可能會檢測出不同的倍性結(jié)果，這也是龔倩穎(2018)檢測發(fā)現(xiàn)海南本地油茶資源倍性復雜的原因之一。進一步研究發(fā)現(xiàn)在流式細胞術檢測的解離液中添加一定濃度的PVP水溶液能有效降低次生代謝物產(chǎn)生的影響，本研究通過改進的流式細胞術對海南油茶進行重新檢測，并通過染色體計數(shù)驗證，證實添加PVP抗氧化劑提高了流式細胞術檢測油茶倍性的準確性，從而明確了海南油茶的倍性情況；但是仍有少部分材料未能通過流式細胞術準確檢測出其倍性，這可能與檢測材料的生理狀態(tài)有關，例如干旱、受病蟲害侵擾、葉片偏老等都可能影響檢測的準確性。流式細胞術有其自身的優(yōu)勢，方便快捷，可用于對野生油茶資源和雜交后代群體等大量材料的倍性進行快速檢測，而為了提高結(jié)果的準確性，可選擇部分材料用染色體計數(shù)法進一步驗證。

研究發(fā)現(xiàn)海南油茶為高倍性的八倍體和十倍體。在染色體計數(shù)過程中八倍體和十倍體都出現(xiàn)了少部分根尖細胞染色體丟失的現(xiàn)象，例如十倍體少部分根尖細胞出現(xiàn)140～149條染色體，但85%以上細胞染色體數(shù)目都是150，八倍體少部分根尖細胞出現(xiàn)115～119條染色體，其中CMZX-612和TCXYL-61流式細胞術檢測疑似七倍體，但是與其他八倍體一樣，染色體計數(shù)90%以上細胞染色體數(shù)目都是120。供試材料中暫時未發(fā)現(xiàn)非整倍體，而少部分根尖細胞染色體丟失的現(xiàn)象，推測是因為高倍性材料的細胞染色體數(shù)量較多，在去壁低滲法制片過程中，經(jīng)酶解去壁的部分根尖細胞極易破碎，導致部分染色體丟失。目前在其他省份分布的山茶屬植物中，只有少數(shù)組有十倍體種的報道(徐曉丹等，2018；Hembreeetal.，2019)，而油茶組中則還沒有十倍體的報道，這表明海南本地油茶不僅外部形態(tài)特征異于其他油茶，在倍性方面也有其特殊之處，共同揭示了海南油茶與其他油茶的差異性。倍性上的特性也佐證了長期以來未受到重視的海南本地油茶確實是在海南島獨特自然環(huán)境下形成的一個地理小種，同時也說明油茶多倍體的形成不僅僅是受到人工馴化和人工選擇的影響(李光濤等，1990；Guetal.，1988)。植物多倍化是其形成新物種的重要途徑之一，也是植物適應自然環(huán)境變化的一種機制，多倍體物種的分布范圍與經(jīng)緯度和生境有較強的相關性(李霖鋒等，2019)。Cheng等(2020)對全球范圍內(nèi)多種細胞類型的加拿大一枝黃花(Solidagocanadensis)進行研究表明：與典型的多倍化增強植物耐寒性的機制不同，巨大的基因組冗余也增強了多倍體加拿大一枝黃花適應熱脅迫條件，多倍體化促進了加拿大一枝黃花耐熱性的提高和向中國亞熱帶地區(qū)的擴展。而張文駒等(1999)通過山茶屬的細胞地理學研究表明：山茶屬植物起源于中南半島，多倍體多分布于西部、西北部和北部地區(qū)。由此推測，油茶由起源中心向周圍地區(qū)擴張，向北部和西部等干旱寒冷的高海拔地區(qū)擴展時，是由二倍體向六倍體進化，中間過渡形成了四倍體，以適應干旱、寒冷的惡劣自然環(huán)境；同時向南部地區(qū)擴張時油茶由二倍體向八倍體、十倍體進化，以適應南部更為炎熱多雨的低海拔自然環(huán)境，這也與顧志建(1997)對滇山茶(Camelliareticulata)倍性演變趨勢的研究結(jié)果相似。

植物倍性對諸多性狀都有影響，多倍體植物通常都表現(xiàn)出器官的巨大性(賈文慶，2015)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在油茶組內(nèi)，油茶的單果質(zhì)量與倍性呈正相關，即油茶倍性越高其單果質(zhì)量越大。對不同倍性油茶的單果質(zhì)量進行實地調(diào)查測量和文獻數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明：二倍體大花窄葉油茶單果質(zhì)量0.68～6.70 g，四倍體小果油茶單果質(zhì)量1.61～15.64 g，六倍體普通油茶單果質(zhì)量8.00～65.00 g，八倍體越南油茶、海南油茶單果質(zhì)量56.20～187.59 g，十倍體海南油茶單果質(zhì)量22.84～192.37 g。因此倍性育種或有助于培育單果質(zhì)量大、易采收的油茶品種，降低采收成本。此外，很多人工創(chuàng)制的多倍體植物均表現(xiàn)出育性下降的特性(李霖鋒等，2019)，如種間六倍體柑橘(郭文武等，2007)、三倍體蘋果(Malus)、誘變的四倍體桃(Amygdalus)和李(Prunus)等都表現(xiàn)出育性降低的特性(孫慶華等，2008)。這可能是因為人為創(chuàng)制的多倍體材料和奇數(shù)倍多倍體因染色體組間的穩(wěn)定性被擾亂，導致育性降低。而天然多倍體特別是偶數(shù)倍多倍體，因染色體組較穩(wěn)定，經(jīng)長時間自然選擇而保存下來，其育性一般都較正常，如天然四倍體枇杷(Eriobotryajaponica)相比于二倍體育性有所降低，但是仍有較高育性(梁森林等，2018)，天然的八倍體草莓(Fragaria×ananassa)(Whitakeretal.，2020)和二十二倍體新疆藥桑(黑桑Morusnigra)(蔡得田等，2011)也都保持著正常育性。本課題組收集的油茶資源中，包括海南油茶在內(nèi)，三倍體和五倍體油茶花粉育性極低，只能少量結(jié)實，而二倍體及偶數(shù)倍多倍體的花粉育性和結(jié)實率均較高(未發(fā)表數(shù)據(jù))，也說明天然偶數(shù)倍多倍體可保持正常的育性。

4 結(jié)論

供試的海南油茶的倍性為八倍體和十倍體，且十倍體占83.3%，同時從倍性的角度也佐證了海南本地油茶確實是在海南島獨特自然環(huán)境下形成的一個地理小種。明確海南油茶的倍性，也將為以后更好地利用海南油茶資源提供便利，為開展海南油茶雜交育種、遺傳進化機制等研究奠定基礎。