王 興,楊 靜 ,劉芙蓉,郝勝菊,張 釧 ,劉自華
(1.甘肅省婦幼保健院,甘肅 蘭州 730050;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院兒童發(fā)育行為科,甘肅 蘭州 730050 3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院輸血科,甘肅 蘭州 730050)
關(guān)鍵字:傳代培養(yǎng);嵌合體;非整倍體
人類正常體細(xì)胞是包括22 對常染色體和1 對性染色體(XX/XY),屬于二倍體生物細(xì)胞。當(dāng)整倍體染色體中缺少或額外增加一條或若干條染色體時(shí)稱為非整倍體,一般是在減數(shù)分裂時(shí)一對同源染色體不分離或提前分離而形成n-1 或n+1 的配子,這類配子彼此結(jié)合或同正常配子(n)結(jié)合,產(chǎn)生各種非整倍體細(xì)胞。較為常見的非整倍體有21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征以及性染色體數(shù)目異常導(dǎo)致的克氏/特納綜合征等[1]。而在非整倍體患者存在一種特殊類型,即同時(shí)存在正常細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞的嵌合體,該類患者的病情輕重往往與其異常細(xì)胞的嵌合比例及來源胚層相關(guān)[2]。
染色體核型分析是目前診斷非整倍體異常最常用的方法,但該方法檢測前需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),尤其是羊水細(xì)胞常需要傳代培養(yǎng)。本研究通過對兩例嵌合型非整倍體患者外周血細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),使用FISH 檢測計(jì)數(shù)異常核型細(xì)胞的嵌合比例,探討傳代培養(yǎng)對嵌合型非整倍體計(jì)數(shù)嵌合比例的影響。
2019 年在我院確診的1 例嵌合型21-三體綜合征患者和1 例嵌合型特納綜合征患者,經(jīng)患者知情同意,采其外周血樣本進(jìn)行研究。
①細(xì)胞培養(yǎng):肝素抗凝管采集患者3mL 外周血,取0.5mL 作為原代分析樣本;取0.2mL 接種于外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液(河南賽諾特生物技術(shù)有限公司)中37℃培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h 后,取0.5mL 樣本作為傳代1分析樣本;取0.2mL 培養(yǎng)后樣本再次傳代培養(yǎng)72h 后,取0.5mL 樣本作為傳代2分析樣本。
②FISH 實(shí)驗(yàn):采用含GLP13/21、CSP18/X/Y 兩組熒光探針的FISH 非整倍體檢測試劑盒(北京金菩嘉試劑有限公司),經(jīng)外周血組織標(biāo)本經(jīng)制片處理后進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。
③FISH 結(jié)果判讀:使用徠卡DM6000B 熒光顯微鏡觀察,GLP13/21 探針組中GLP21 探針示紅色信號,CSP18/X/Y 探針組中CSPX 示綠色信號、CSPY探針示紅色信號,選擇背景干凈、信號清晰、形態(tài)完整的細(xì)胞,計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞內(nèi)FISH 的雜交信號。
對兩例樣本三個(gè)培養(yǎng)水平(原代、傳代1、傳代2)的FISH 檢測結(jié)果顯示,
嵌合型21-三體綜合征和特納綜合征患者的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)傳代培養(yǎng)后,異常細(xì)胞所占比例逐漸下降。嵌合型21-三體綜合征異常細(xì)胞比例分別為94.5%(189/200)、82.5%(165/200)、69.5%(139/200);嵌合型特納綜合征異常細(xì)胞比例分別為71.0%(142/200)、36.5%(73/200)、27.5%(55/200)。檢測結(jié)果見表1。
表1 FISH 檢出異常核型細(xì)胞比例
嵌合型非整倍體患者體內(nèi)同時(shí)包含兩種以上核型的細(xì)胞系,其臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度往往與異常細(xì)胞的嵌合比例呈正相關(guān),異常核型細(xì)胞占比越高,其臨床表現(xiàn)越重;反之,則越輕。然而,也有少數(shù)病例會(huì)出現(xiàn)核型比例與臨床癥狀不相關(guān)的現(xiàn)象,這可能與體細(xì)胞鑲嵌體有關(guān)[3]。
國內(nèi)研究顯示在實(shí)施胎兒羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析時(shí)出現(xiàn)嵌合體的情況達(dá)0.29%~0.46%[4~6],并且進(jìn)行后續(xù)臍血核型分析時(shí),部分嵌合體轉(zhuǎn)正常。出現(xiàn)這種情況,有學(xué)者認(rèn)為是羊水細(xì)胞包括了胎兒三個(gè)胚層的細(xì)胞,而臍血來源于循環(huán)系統(tǒng),屬于中胚層細(xì)胞,故兩個(gè)檢測結(jié)果存在偏差可能是由于檢測樣本胚層來源不同造成的[5,7]。同時(shí)根據(jù)Hook等人[8]曾提出“救援”細(xì)胞系(rescue line)學(xué)說,認(rèn)為存活的特納綜合征患者,在個(gè)體不同組織當(dāng)中必定存在“救援”細(xì)胞系,患者才能夠存活,即認(rèn)為特納綜合患者體內(nèi)除45,X0 核型外,具有正常的46,XX細(xì)胞系作為“救援”細(xì)胞系存在于患者發(fā)育的不同階段或不同組織中。基于上述假設(shè),目前常規(guī)染色體核型分析方法檢測到70%特納綜合征患者為染色體嵌合體核型,其余30%患者有可能存在的嵌合體核型沒有被準(zhǔn)確檢出。
傳代培養(yǎng)在細(xì)胞生長不良時(shí),可大大提高細(xì)胞的培養(yǎng)成功率,尤其在產(chǎn)前羊水細(xì)胞培養(yǎng)中,減少對孕婦及胎兒二次羊水穿刺傷害[9]。本研究意在探討傳代培養(yǎng)對嵌合型非整倍體計(jì)數(shù)結(jié)果的影響,我們使用兩例已確診嵌合型非整倍體外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),使用FISH 技術(shù)計(jì)數(shù),結(jié)果顯示異常核型細(xì)胞占比在傳代培養(yǎng)后逐漸降低,該結(jié)果與Atkins[10]和Sultana[11]等人對嵌合型特納綜合征患者進(jìn)行研究顯示培養(yǎng)后的性腺組織細(xì)胞中異常核型占比較培養(yǎng)前減少相符,說明在體外細(xì)胞培養(yǎng)中不同細(xì)胞系間可能存在生長優(yōu)劣勢的差異性。
因此,嵌合型染色體核型的檢出受到分析細(xì)胞數(shù)目、檢測樣本類型、檢測方法以及體內(nèi)外不同細(xì)胞系的優(yōu)勢生長等因素影響,導(dǎo)致最終的分析結(jié)果無法與患者的表型完全相符。根據(jù)本研究中顯示的傳代培養(yǎng)中正常核型細(xì)胞處于優(yōu)勢生長的現(xiàn)象,在臨床工作中選擇性的傳代培養(yǎng)進(jìn)行核型檢測,有利于嵌合型非整倍體的檢出率;同時(shí),原代細(xì)胞能更好的反應(yīng)患者真實(shí)嵌合比例情況。