尚 菲，汪 慧，王春林，宋 曦，段春燕

（1.甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室，甘肅 慶陽 745000；2.隴東學院 生命科學與技術學院 甘肅 慶陽 745000；3.隴東學院 農(nóng)林科技學院，甘肅 慶陽 745000）

植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是和植物共同生長、互惠互利、協(xié)同作用的一類真菌[1]。內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生相似或相同于植物的新型天然活性物質(zhì)，此活性物質(zhì)能夠發(fā)揮其抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化等多種生物的活性作用[2]。絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)為葫蘆科多年生蔓生草本植物，為我國的傳統(tǒng)中藥，其有效的成分絞股藍皂苷內(nèi)含多種重要生物學作用[3]。近年來生態(tài)環(huán)境破壞導致藥材資源減少，研究絞股藍內(nèi)生真菌資源及其代謝產(chǎn)物，可為尋找絞股藍皂苷資源等緊缺、新型的具有活性的天然產(chǎn)物奠定基礎[4]。

國內(nèi)外諸多學者對絞股藍內(nèi)生真菌進行了研究。馬生龍[5]用HPLC 法檢測皂苷A 含量，探討了不同產(chǎn)地、類型的絞股藍內(nèi)生真菌的多樣性和其有效成分絞股藍皂苷A 的關系。孟素香[6]利用實驗方法研究絞股藍內(nèi)生真菌（JY25）對金黃色葡萄球菌的抗菌機制。范文慧[7]以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為標準指示菌對絞股藍內(nèi)生真菌（JY25）的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化分析。李傳民[8]以胞外多糖量產(chǎn)作為指標，用單因素分析及正交試驗對接種量、培養(yǎng)時間、碳氮源進行分析優(yōu)化，以期達到胞外多糖高產(chǎn)的效果?，F(xiàn)有文獻大多是對內(nèi)生真菌抗菌性、多樣性等研究，而對于絞股藍內(nèi)生真菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究較少。文章擬采用微生物學常規(guī)分離方法從絞股藍的根組織中分離內(nèi)生真菌，再采用TLC 法和HPLC 法篩選出與宿主植物產(chǎn)生相似或相同活性成分的絞股藍皂苷菌株。再通過單因素分析和正交試驗的方法，優(yōu)化絞股藍菌株的培養(yǎng)基及培養(yǎng)基礎條件，以期實現(xiàn)絞股藍皂苷的代謝產(chǎn)量，為保護藥用植物資源等提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

絞股藍全草（栽培七葉），于2017 年4 月采集于陜西師范大學（長安校區(qū)）絞股藍栽培基地，樣品經(jīng)陜西師范大學生科院鑒定均為葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍 Gynostemma pentaphyllum (Thunb)Makino。

1.2 主要試驗用培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：200g新鮮馬鈴薯，去皮煮沸30min后過濾收集濾液，20g 葡萄糖，1.5%瓊脂，加水至1000mL，自然pH，121℃滅菌30min。

豆芽汁液體培養(yǎng)基：黃豆芽100g，葡萄糖50g，水1000 mL，pH 自然。稱鮮豆芽100g 煮沸約30min，用紗布過濾，加入葡萄糖溶化后補足水至1000 mL。

查氏液體培養(yǎng)基：NaNO32g，K2HPO41g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，蔗糖30g，水1000mL，pH 自然。

玉米粉液體培養(yǎng)基：玉米粉60g，KH2PO43g，維生素B1 100mg，蔗糖10g，MgSO4·7H2O1.5g，水1000mL。

1.3 主要試劑

鏈霉素(Amresco，批號：LOT2010/07)；青霉素鈉(哈藥集團制藥廠，批號：A061115207.80 萬單位∕瓶)；二苯基苦基苯肼(DPPH 購于Sigma 公司)；絞股藍皂苷標品（遼寧生物醫(yī)藥研究中心121311-200402)；PCR 相關試劑（北京經(jīng)科宏達生物技術有限公司，DOUPSON）。

2 方法

2.1 產(chǎn)絞股藍皂苷內(nèi)生真菌的篩選及鑒定

2.1.1 TLC 初篩

將0.4% CMC-Na 溶液置于硅膠薄層板（GF254），活化后再冷卻待用。采用氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）在10℃以下放置一段時間后，用其下層溶液為展開劑，點樣層析，待取出進行晾干后噴灑硫酸乙醇（10%），105℃高溫進行加熱（10-30 min），直至出現(xiàn)清晰的斑點，然后放置在紫外光燈下檢視（365nm）。

2.1.2 HPLC 復篩

將TLC 呈陽性的樣品用無菌濾膜過濾，HPLC進行檢測，利用絞股藍皂苷標準品甲醇溶液（2mg/mL）陽性對比，色譜條件為Diamomsil C18(2)色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm）；流動相條件為乙腈-水（7：3）；流速為0.85 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為203 nm；進樣體積為10μL。

2.1.3 產(chǎn)絞股藍皂苷內(nèi)生真菌菌株的鑒定

對產(chǎn)絞股藍內(nèi)生真菌菌株的基因進行提取，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，1%瓊脂糖凝膠進行電泳(加入1μL EB)，用凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察凝膠。用通用引物ITS1 和ITS4 進行擴增，擴增的條件為94℃預變性3min、變性1.5min，56℃復性30s，72℃延伸1.5min，共30 個循環(huán)，最后72℃延伸10min。對PCR 的產(chǎn)物測序，利用BLAST 軟件進行對比測序得到的真菌部分（rDNA 序列）與Gen-Bank 庫中已有的序列，從而獲得真菌的分類地位[18]。

2.2 產(chǎn)絞股藍內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用精密儀器吸取0.2mL 的待測液體放置于具塞試管(對照為100%甲醇)，用80℃的高溫蒸干，再加入0.2mL 的香草醛-冰醋酸（5%），0.8mL 的高氯酸，密塞后，用60℃熱水浴約15min，待冷卻以后加入5.0mL 的冰醋酸，最后進行測定標準品和樣品的吸光度（于550nm 處）。用10%的接種量接種到產(chǎn)絞股藍內(nèi)生真菌菌株種子液裝入液量為100 mL/250mL 的PDA、查氏、豆芽、玉米粉的液體培養(yǎng)基里，用28℃恒溫振蕩進行培養(yǎng)[19]。每天采樣一次，并對菌株的菌絲體干重進行測定，發(fā)酵液按標準流程處理，然后用對紫外分光光度法對提取物中的絞股藍皂苷的含量進行測定，明確發(fā)酵培養(yǎng)時間的終點。依據(jù)試驗中篩選的最佳氮源、碳源。為進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，對氮源濃度、碳源濃度、溫度和pH 等四個因素進行正交試驗，見表1。

表1 正交實驗設計方案

3 結果

3.1 TLC 初篩結果

分別用紫外燈和日光燈對樣品和標準品進行TLC 檢視對比分析，結果表明G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物和標準品Rf 值相同的斑點（絞股藍），表明G4 菌株可能會產(chǎn)生絞股藍皂苷內(nèi)生真菌，檢視結果如圖1所示，a 和b分別為絞股藍皂苷標準品和G4 菌株的發(fā)酵菌絲體提取成分。

圖1 TLC 法檢測G4 菌株的菌絲體提取成分

3.2 HPLC 復篩結果

采用HPLC 方法分別對絞股藍皂苷標準品與菌株G4 胞內(nèi)產(chǎn)物進行檢測，檢測結果如圖2 所示。結果顯示G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物，在相同的色譜條件下與標準品在約18min 時出現(xiàn)了相同吸收峰，從而進一步印證G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物中會含有與宿主相似或相同的活性成分（絞股藍皂苷）。

圖2 絞股藍皂苷標準品與G4 菌株胞內(nèi)產(chǎn)物的HPLC 圖譜

3.3 產(chǎn)絞股藍皂苷內(nèi)生真菌菌株的鑒定

產(chǎn)絞股藍皂苷的G4 菌株菌落及顯微照片如圖3 所示，G4 菌株嵌入PDA 培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)基的顏色逐漸變黃，生長較緩慢，圖3-A 為菌落真面，3-B 菌落反面，生長時間為10d。菌落正面為白色，反面為黃色，表面呈凸起，菌落較干燥，邊緣為不規(guī)整分布。G4 菌株的孢子基本為圓形或橢圓，呈串珠狀，菌絲較細，如圖3-C 和3-D 為G4 菌株孢子及菌絲的顯微觀察示意圖。

圖3 G4 菌株的形態(tài)學觀察

4 產(chǎn)絞股藍內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵的優(yōu)化

4.1 不同培養(yǎng)基的選擇

G4 菌株在不同的培養(yǎng)基當中表現(xiàn)的情況不同。圖4 為G4 在不同培養(yǎng)基中的絞股藍皂苷含量曲線，絞股藍皂苷含量最多是在豆芽汁培養(yǎng)基中，達到0.06433±0.001796μg/mL，PDA 液體培養(yǎng)基次之，達 到0.03844±0.000454ug/mL，玉米 粉 培 養(yǎng) 基 為0.02682±0.000568μg/mL，查氏培養(yǎng)基為0.01355±0.000781μg/100mL，表明各培養(yǎng)基之間對于菌株G4的皂苷相對量有明顯的差異性，說明培養(yǎng)基的不同成分對絞股藍皂苷的相對含量影響較大。圖5 表明菌絲干重最大為豆芽汁培養(yǎng)基中，達到0.79880±0.01439g/100mL，豆芽汁培養(yǎng)基中菌絲干重比查氏培養(yǎng)基大約0.6 g/100mL，約為其4 倍。充分說明不同的培養(yǎng)基中不同的營養(yǎng)成分對菌絲的生長影響差異性巨大。綜上所述，G4 菌株的培養(yǎng)基選擇豆芽汁培養(yǎng)基為最佳，利于后續(xù)培養(yǎng)條件的研究。

圖4 不同培養(yǎng)基中的絞股藍皂苷含量曲線

圖5 不同培養(yǎng)基中的菌絲干重曲線

4.2 發(fā)酵條件的單因素選擇

4.2.1 碳源選擇

圖6 為G4 菌株在不同碳源條件下絞股藍皂苷含量和菌絲干重的曲線變化。F 檢驗結果顯示，不同碳源條件下二者含量變化具有明顯的差異性（F=414.622＞F0.05，P＜0.05）。結果表明五種碳源條件下的菌絲干重均比空白對照的高，且葡萄糖碳源的菌絲干重最大，蔗糖次之。結果表明五種碳源條件下的絞股藍皂苷含量均比空白對照的高，且葡萄糖碳源的絞股藍皂苷含量最大，蔗糖次之。綜述所述，G4 菌株在不同碳源條件下的能力表現(xiàn)出一定差異性，葡萄糖與其它的碳源相比，既有利菌絲體的生長，又有利絞股藍皂苷含量的積累，最佳碳源為葡萄糖。

圖6 不同碳源中的菌絲干重和絞股藍皂苷含量變化曲線

4.2.2 氮源選擇

圖7 為G4 菌株在不同氮源條件下不同氮源中的菌絲干重和絞股藍皂苷含量變化曲線示意圖。F檢驗結果顯示，不同氮源的培養(yǎng)基上G4 菌株的菌絲干重和絞股藍皂苷含量具有顯著的差異性（F=414.622＞F0.05，P＜0.05）。菌絲干重曲線結果表明，當?shù)礊橄跛徜@時，菌絲干重為最大值，為0.7455±0.01384g/100mL；當?shù)礊橄跛徕c時，菌絲干重為第二大值，為0.5355±0.01433g/100mL；當?shù)礊榈鞍纂?、酵母膏和尿素時，分別為0.4288±0.01645g/100mL、0.4605 ±0.00983g/100mL、0.4088 ±0.01101g/100mL；菌絲干重數(shù)值基本相等；空白對照組數(shù)值基本為0.3855±0.01243g/100mL；不同氮源均高于空白對照組。絞股藍皂苷含量曲線結果表明，氮源為硝酸鈉、蛋白胨和酵母膏時，絞股藍皂苷含量基本相等。氮源為尿素和空白對照時，二者之間的絞股藍皂苷含量也無顯著差異。綜上所述，G4 菌株在不同氮源條件下的能力表現(xiàn)出一定的差異性，硝酸銨與其它氮源對比，既有利于菌絲體的生長，又有利于絞股藍皂苷含量的積累，最佳氮源為硝酸銨。

圖7 不同氮源中的菌絲干重和絞股藍皂苷含量變化曲線

4.3 發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

利用正交試驗對產(chǎn)絞股藍內(nèi)生真菌的菌株培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，其結果與分析見表2。從表中可以得出，當培養(yǎng)基采用A3B1C3D2時，G4菌株發(fā)酵所得的菌絲干重值最大，為0.822 g/100m；從K1到極值R1，四個因素對發(fā)酵所得菌絲干重影響的排序依次為RA＞RC＞RD＞RB，即碳源影響最大，溫度影響次之，第三影響因素為pH，氮源時最小影響因素。在G4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中，如若要獲得大量的菌絲，則可對豆芽汁培養(yǎng)基進行調(diào)整，即硝酸銨0.2%，葡萄糖3.0%，溫度28℃，pH7.0，即能節(jié)省時間，又能降低成本；若想獲得大量的絞股藍皂苷，則以豆芽汁培養(yǎng)基作為基礎進行微調(diào)整，即硝酸銨0.3%，葡糖糖3.0%，溫度28℃，pH7.0。通過對比初始配比的豆芽汁培養(yǎng)基和正交試驗優(yōu)化的最佳配比，采用這兩種培養(yǎng)基分別對G4 菌株培養(yǎng)，結果表明，菌絲干重最大值為0.854 g/100mL，增加了5.13%；絞股藍皂苷含量最大值為0.069μg/mL，增加了11.30%；同時發(fā)酵最大值從原來的8d 減低為6d，節(jié)約了發(fā)酵時間成本。

表2 正交試驗結果與分析

5 結論

（1）采用TLC 法和HPLC 法成功篩選出G4 菌株為產(chǎn)絞股藍皂苷內(nèi)生真菌的菌株。TLC 結果表明G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物與標準品有相同的Rf值；HPLC結果表明G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物與標準品有相同的吸收峰（18min）。從而推斷G4 菌株會產(chǎn)生與宿主相似或相同的活性成分。

續(xù)表2

（2）利用豆芽汁、PDA 液體、查氏、玉米粉培養(yǎng)基對產(chǎn)絞股藍皂苷內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵條件的進行優(yōu)化。結果表明，豆芽汁培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基，既有利于菌絲體生長，又有利于絞股藍皂苷積累。通過單因素分析，確定葡萄糖為最佳碳源，硝酸銨為最佳氮源。通過正交試驗分析，菌絲生長和絞股藍皂苷積累的最佳配比是將豆芽培養(yǎng)基的配比分別控制在硝酸銨0.2%或硝酸銨0.3%，葡萄糖3.0%，溫度28℃，pH7.0；二者的配比僅僅硝酸銨濃度有區(qū)別，其他條件保持一致。