尚 菲，汪 慧，王春林，宋 曦，段春燕

（1.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 慶陽(yáng) 745000；2.隴東學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 甘肅 慶陽(yáng) 745000；3.隴東學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅 慶陽(yáng) 745000）

植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是和植物共同生長(zhǎng)、互惠互利、協(xié)同作用的一類(lèi)真菌[1]。內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生相似或相同于植物的新型天然活性物質(zhì)，此活性物質(zhì)能夠發(fā)揮其抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化等多種生物的活性作用[2]。絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum)為葫蘆科多年生蔓生草本植物，為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，其有效的成分絞股藍(lán)皂苷內(nèi)含多種重要生物學(xué)作用[3]。近年來(lái)生態(tài)環(huán)境破壞導(dǎo)致藥材資源減少，研究絞股藍(lán)內(nèi)生真菌資源及其代謝產(chǎn)物，可為尋找絞股藍(lán)皂苷資源等緊缺、新型的具有活性的天然產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)[4]。

國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)絞股藍(lán)內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究。馬生龍[5]用HPLC 法檢測(cè)皂苷A 含量，探討了不同產(chǎn)地、類(lèi)型的絞股藍(lán)內(nèi)生真菌的多樣性和其有效成分絞股藍(lán)皂苷A 的關(guān)系。孟素香[6]利用實(shí)驗(yàn)方法研究絞股藍(lán)內(nèi)生真菌（JY25）對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌機(jī)制。范文慧[7]以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為標(biāo)準(zhǔn)指示菌對(duì)絞股藍(lán)內(nèi)生真菌（JY25）的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化分析。李傳民[8]以胞外多糖量產(chǎn)作為指標(biāo)，用單因素分析及正交試驗(yàn)對(duì)接種量、培養(yǎng)時(shí)間、碳氮源進(jìn)行分析優(yōu)化，以期達(dá)到胞外多糖高產(chǎn)的效果?，F(xiàn)有文獻(xiàn)大多是對(duì)內(nèi)生真菌抗菌性、多樣性等研究，而對(duì)于絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究較少。文章擬采用微生物學(xué)常規(guī)分離方法從絞股藍(lán)的根組織中分離內(nèi)生真菌，再采用TLC 法和HPLC 法篩選出與宿主植物產(chǎn)生相似或相同活性成分的絞股藍(lán)皂苷菌株。再通過(guò)單因素分析和正交試驗(yàn)的方法，優(yōu)化絞股藍(lán)菌株的培養(yǎng)基及培養(yǎng)基礎(chǔ)條件，以期實(shí)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷的代謝產(chǎn)量，為保護(hù)藥用植物資源等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

絞股藍(lán)全草（栽培七葉），于2017 年4 月采集于陜西師范大學(xué)（長(zhǎng)安校區(qū)）絞股藍(lán)栽培基地，樣品經(jīng)陜西師范大學(xué)生科院鑒定均為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán) Gynostemma pentaphyllum (Thunb)Makino。

1.2 主要試驗(yàn)用培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：200g新鮮馬鈴薯，去皮煮沸30min后過(guò)濾收集濾液，20g 葡萄糖，1.5%瓊脂，加水至1000mL，自然pH，121℃滅菌30min。

豆芽汁液體培養(yǎng)基：黃豆芽100g，葡萄糖50g，水1000 mL，pH 自然。稱鮮豆芽100g 煮沸約30min，用紗布過(guò)濾，加入葡萄糖溶化后補(bǔ)足水至1000 mL。

查氏液體培養(yǎng)基：NaNO32g，K2HPO41g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，蔗糖30g，水1000mL，pH 自然。

玉米粉液體培養(yǎng)基：玉米粉60g，KH2PO43g，維生素B1 100mg，蔗糖10g，MgSO4·7H2O1.5g，水1000mL。

1.3 主要試劑

鏈霉素(Amresco，批號(hào)：LOT2010/07)；青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥廠，批號(hào)：A061115207.80 萬(wàn)單位∕瓶)；二苯基苦基苯肼(DPPH 購(gòu)于Sigma 公司)；絞股藍(lán)皂苷標(biāo)品（遼寧生物醫(yī)藥研究中心121311-200402)；PCR 相關(guān)試劑（北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，DOUPSON）。

2 方法

2.1 產(chǎn)絞股藍(lán)皂苷內(nèi)生真菌的篩選及鑒定

2.1.1 TLC 初篩

將0.4% CMC-Na 溶液置于硅膠薄層板（GF254），活化后再冷卻待用。采用氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）在10℃以下放置一段時(shí)間后，用其下層溶液為展開(kāi)劑，點(diǎn)樣層析，待取出進(jìn)行晾干后噴灑硫酸乙醇（10%），105℃高溫進(jìn)行加熱（10-30 min），直至出現(xiàn)清晰的斑點(diǎn)，然后放置在紫外光燈下檢視（365nm）。

2.1.2 HPLC 復(fù)篩

將TLC 呈陽(yáng)性的樣品用無(wú)菌濾膜過(guò)濾，HPLC進(jìn)行檢測(cè)，利用絞股藍(lán)皂苷標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液（2mg/mL）陽(yáng)性對(duì)比，色譜條件為Diamomsil C18(2)色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相條件為乙腈-水（7：3）；流速為0.85 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；進(jìn)樣體積為10μL。

2.1.3 產(chǎn)絞股藍(lán)皂苷內(nèi)生真菌菌株的鑒定

對(duì)產(chǎn)絞股藍(lán)內(nèi)生真菌菌株的基因進(jìn)行提取，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(加入1μL EB)，用凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察凝膠。用通用引物ITS1 和ITS4 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的條件為94℃預(yù)變性3min、變性1.5min，56℃復(fù)性30s，72℃延伸1.5min，共30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。對(duì)PCR 的產(chǎn)物測(cè)序，利用BLAST 軟件進(jìn)行對(duì)比測(cè)序得到的真菌部分（rDNA 序列）與Gen-Bank 庫(kù)中已有的序列，從而獲得真菌的分類(lèi)地位[18]。

2.2 產(chǎn)絞股藍(lán)內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用精密儀器吸取0.2mL 的待測(cè)液體放置于具塞試管(對(duì)照為100%甲醇)，用80℃的高溫蒸干，再加入0.2mL 的香草醛-冰醋酸（5%），0.8mL 的高氯酸，密塞后，用60℃熱水浴約15min，待冷卻以后加入5.0mL 的冰醋酸，最后進(jìn)行測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度（于550nm 處）。用10%的接種量接種到產(chǎn)絞股藍(lán)內(nèi)生真菌菌株種子液裝入液量為100 mL/250mL 的PDA、查氏、豆芽、玉米粉的液體培養(yǎng)基里，用28℃恒溫振蕩進(jìn)行培養(yǎng)[19]。每天采樣一次，并對(duì)菌株的菌絲體干重進(jìn)行測(cè)定，發(fā)酵液按標(biāo)準(zhǔn)流程處理，然后用對(duì)紫外分光光度法對(duì)提取物中的絞股藍(lán)皂苷的含量進(jìn)行測(cè)定，明確發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的終點(diǎn)。依據(jù)試驗(yàn)中篩選的最佳氮源、碳源。為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，對(duì)氮源濃度、碳源濃度、溫度和pH 等四個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

3 結(jié)果

3.1 TLC 初篩結(jié)果

分別用紫外燈和日光燈對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TLC 檢視對(duì)比分析，結(jié)果表明G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品Rf 值相同的斑點(diǎn)（絞股藍(lán)），表明G4 菌株可能會(huì)產(chǎn)生絞股藍(lán)皂苷內(nèi)生真菌，檢視結(jié)果如圖1所示，a 和b分別為絞股藍(lán)皂苷標(biāo)準(zhǔn)品和G4 菌株的發(fā)酵菌絲體提取成分。

圖1 TLC 法檢測(cè)G4 菌株的菌絲體提取成分

3.2 HPLC 復(fù)篩結(jié)果

采用HPLC 方法分別對(duì)絞股藍(lán)皂苷標(biāo)準(zhǔn)品與菌株G4 胞內(nèi)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果顯示G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物，在相同的色譜條件下與標(biāo)準(zhǔn)品在約18min 時(shí)出現(xiàn)了相同吸收峰，從而進(jìn)一步印證G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物中會(huì)含有與宿主相似或相同的活性成分（絞股藍(lán)皂苷）。

圖2 絞股藍(lán)皂苷標(biāo)準(zhǔn)品與G4 菌株胞內(nèi)產(chǎn)物的HPLC 圖譜

3.3 產(chǎn)絞股藍(lán)皂苷內(nèi)生真菌菌株的鑒定

產(chǎn)絞股藍(lán)皂苷的G4 菌株菌落及顯微照片如圖3 所示，G4 菌株嵌入PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，培養(yǎng)基的顏色逐漸變黃，生長(zhǎng)較緩慢，圖3-A 為菌落真面，3-B 菌落反面，生長(zhǎng)時(shí)間為10d。菌落正面為白色，反面為黃色，表面呈凸起，菌落較干燥，邊緣為不規(guī)整分布。G4 菌株的孢子基本為圓形或橢圓，呈串珠狀，菌絲較細(xì)，如圖3-C 和3-D 為G4 菌株孢子及菌絲的顯微觀察示意圖。

圖3 G4 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

4 產(chǎn)絞股藍(lán)內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵的優(yōu)化

4.1 不同培養(yǎng)基的選擇

G4 菌株在不同的培養(yǎng)基當(dāng)中表現(xiàn)的情況不同。圖4 為G4 在不同培養(yǎng)基中的絞股藍(lán)皂苷含量曲線，絞股藍(lán)皂苷含量最多是在豆芽汁培養(yǎng)基中，達(dá)到0.06433±0.001796μg/mL，PDA 液體培養(yǎng)基次之，達(dá) 到0.03844±0.000454ug/mL，玉米 粉 培 養(yǎng) 基 為0.02682±0.000568μg/mL，查氏培養(yǎng)基為0.01355±0.000781μg/100mL，表明各培養(yǎng)基之間對(duì)于菌株G4的皂苷相對(duì)量有明顯的差異性，說(shuō)明培養(yǎng)基的不同成分對(duì)絞股藍(lán)皂苷的相對(duì)含量影響較大。圖5 表明菌絲干重最大為豆芽汁培養(yǎng)基中，達(dá)到0.79880±0.01439g/100mL，豆芽汁培養(yǎng)基中菌絲干重比查氏培養(yǎng)基大約0.6 g/100mL，約為其4 倍。充分說(shuō)明不同的培養(yǎng)基中不同的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)菌絲的生長(zhǎng)影響差異性巨大。綜上所述，G4 菌株的培養(yǎng)基選擇豆芽汁培養(yǎng)基為最佳，利于后續(xù)培養(yǎng)條件的研究。

圖4 不同培養(yǎng)基中的絞股藍(lán)皂苷含量曲線

圖5 不同培養(yǎng)基中的菌絲干重曲線

4.2 發(fā)酵條件的單因素選擇

4.2.1 碳源選擇

圖6 為G4 菌株在不同碳源條件下絞股藍(lán)皂苷含量和菌絲干重的曲線變化。F 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同碳源條件下二者含量變化具有明顯的差異性（F=414.622＞F0.05，P＜0.05）。結(jié)果表明五種碳源條件下的菌絲干重均比空白對(duì)照的高，且葡萄糖碳源的菌絲干重最大，蔗糖次之。結(jié)果表明五種碳源條件下的絞股藍(lán)皂苷含量均比空白對(duì)照的高，且葡萄糖碳源的絞股藍(lán)皂苷含量最大，蔗糖次之。綜述所述，G4 菌株在不同碳源條件下的能力表現(xiàn)出一定差異性，葡萄糖與其它的碳源相比，既有利菌絲體的生長(zhǎng)，又有利絞股藍(lán)皂苷含量的積累，最佳碳源為葡萄糖。

圖6 不同碳源中的菌絲干重和絞股藍(lán)皂苷含量變化曲線

4.2.2 氮源選擇

圖7 為G4 菌株在不同氮源條件下不同氮源中的菌絲干重和絞股藍(lán)皂苷含量變化曲線示意圖。F檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同氮源的培養(yǎng)基上G4 菌株的菌絲干重和絞股藍(lán)皂苷含量具有顯著的差異性（F=414.622＞F0.05，P＜0.05）。菌絲干重曲線結(jié)果表明，當(dāng)?shù)礊橄跛徜@時(shí)，菌絲干重為最大值，為0.7455±0.01384g/100mL；當(dāng)?shù)礊橄跛徕c時(shí)，菌絲干重為第二大值，為0.5355±0.01433g/100mL；當(dāng)?shù)礊榈鞍纂?、酵母膏和尿素時(shí)，分別為0.4288±0.01645g/100mL、0.4605 ±0.00983g/100mL、0.4088 ±0.01101g/100mL；菌絲干重?cái)?shù)值基本相等；空白對(duì)照組數(shù)值基本為0.3855±0.01243g/100mL；不同氮源均高于空白對(duì)照組。絞股藍(lán)皂苷含量曲線結(jié)果表明，氮源為硝酸鈉、蛋白胨和酵母膏時(shí)，絞股藍(lán)皂苷含量基本相等。氮源為尿素和空白對(duì)照時(shí)，二者之間的絞股藍(lán)皂苷含量也無(wú)顯著差異。綜上所述，G4 菌株在不同氮源條件下的能力表現(xiàn)出一定的差異性，硝酸銨與其它氮源對(duì)比，既有利于菌絲體的生長(zhǎng)，又有利于絞股藍(lán)皂苷含量的積累，最佳氮源為硝酸銨。

圖7 不同氮源中的菌絲干重和絞股藍(lán)皂苷含量變化曲線

4.3 發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

利用正交試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)絞股藍(lán)內(nèi)生真菌的菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，其結(jié)果與分析見(jiàn)表2。從表中可以得出，當(dāng)培養(yǎng)基采用A3B1C3D2時(shí)，G4菌株發(fā)酵所得的菌絲干重值最大，為0.822 g/100m；從K1到極值R1，四個(gè)因素對(duì)發(fā)酵所得菌絲干重影響的排序依次為RA＞RC＞RD＞RB，即碳源影響最大，溫度影響次之，第三影響因素為pH，氮源時(shí)最小影響因素。在G4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中，如若要獲得大量的菌絲，則可對(duì)豆芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整，即硝酸銨0.2%，葡萄糖3.0%，溫度28℃，pH7.0，即能節(jié)省時(shí)間，又能降低成本；若想獲得大量的絞股藍(lán)皂苷，則以豆芽汁培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)進(jìn)行微調(diào)整，即硝酸銨0.3%，葡糖糖3.0%，溫度28℃，pH7.0。通過(guò)對(duì)比初始配比的豆芽汁培養(yǎng)基和正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳配比，采用這兩種培養(yǎng)基分別對(duì)G4 菌株培養(yǎng)，結(jié)果表明，菌絲干重最大值為0.854 g/100mL，增加了5.13%；絞股藍(lán)皂苷含量最大值為0.069μg/mL，增加了11.30%；同時(shí)發(fā)酵最大值從原來(lái)的8d 減低為6d，節(jié)約了發(fā)酵時(shí)間成本。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

5 結(jié)論

（1）采用TLC 法和HPLC 法成功篩選出G4 菌株為產(chǎn)絞股藍(lán)皂苷內(nèi)生真菌的菌株。TLC 結(jié)果表明G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品有相同的Rf值；HPLC結(jié)果表明G4 菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品有相同的吸收峰（18min）。從而推斷G4 菌株會(huì)產(chǎn)生與宿主相似或相同的活性成分。

續(xù)表2

（2）利用豆芽汁、PDA 液體、查氏、玉米粉培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)絞股藍(lán)皂苷內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵條件的進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，豆芽汁培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基，既有利于菌絲體生長(zhǎng)，又有利于絞股藍(lán)皂苷積累。通過(guò)單因素分析，確定葡萄糖為最佳碳源，硝酸銨為最佳氮源。通過(guò)正交試驗(yàn)分析，菌絲生長(zhǎng)和絞股藍(lán)皂苷積累的最佳配比是將豆芽培養(yǎng)基的配比分別控制在硝酸銨0.2%或硝酸銨0.3%，葡萄糖3.0%，溫度28℃，pH7.0；二者的配比僅僅硝酸銨濃度有區(qū)別，其他條件保持一致。