孔玄慶，喻 快，羅澤偉，歐曉明,*，李建明，蔣 煜，郭 軍，金晨鐘

(1.湖南化工研究院 國家農(nóng)藥創(chuàng)制工程研究中心/湖南省農(nóng)用化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410014；2.湖南化研院檢測技術(shù)有限公司,湖南 長沙 410014；3.湖南人文科技學(xué)院/農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000)

農(nóng)藥作為重要的戰(zhàn)略支農(nóng)物資，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著不可或缺的作用。然而，農(nóng)田特別是稻田施用的農(nóng)藥不可避免地通過漂移、雨水沖刷、地表徑流等多種途徑進(jìn)入水體中,發(fā)生一系列的環(huán)境化學(xué)行為，危及水生生物的安全并通過食物鏈可危害人類的健康[1-2]。因此,開展農(nóng)藥對水生生物的毒性效應(yīng)研究，對評價(jià)農(nóng)藥對水生生物的危害以及安全合理使用準(zhǔn)則的制定具有重要的意義。

斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)是一種廣泛存在于我國水體中的淡水單細(xì)胞藻類，因其具有對毒物敏感、個(gè)體小、實(shí)驗(yàn)室易培養(yǎng)、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)而在國際上被廣泛用于污染物毒性評價(jià)[2-4]。雙唑草腈(pyraclonil)，化學(xué)名稱為1-(3-氯-4,5,6,7-四氫吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-炔基)氨基]吡唑-4-腈，是德國拜耳公司于1992年研發(fā)的一種具吡唑并吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)的新型除草劑，主要用于稻田防除稗草、牛毛氈、鴨舌草、田皂角、紫水莧菜等多種一年生和多年生雜草，且對作物安全[5-6]。目前國內(nèi)有關(guān)雙唑草腈的研究主要集中于合成和應(yīng)用技術(shù)[5-7]，而其對水生生物的生態(tài)毒性效應(yīng)研究報(bào)道頗少[8]。基于此，本文在前期工作基礎(chǔ)上[8]，以斜生柵藻為試驗(yàn)對象，開展了其對雙唑草腈脅迫的響應(yīng)研究，旨在為雙唑草腈對水生生物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑與藥品 主要儀器：LC-20A型高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器和化學(xué)工作站，UV-1750型紫外可見分光光度計(jì)，AUY220型電子天平，XSP-2C-1型生物顯微鏡，MIKRO 220R型離心機(jī)等。

試劑與藥品：甲醇(色譜純)、丙酮(分析純)和吐溫-80；超純水，由實(shí)驗(yàn)室通過Milipore制備：水生4號培養(yǎng)基[9-10]，實(shí)驗(yàn)室配制；雙唑草腈原藥，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)純度為97.5%。

1.2 供試生物 斜生柵藻引種于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，在溫度21～24℃、光照強(qiáng)度4 440～8 880 lx、連續(xù)光照的環(huán)境條件下振蕩培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雙唑草腈在藻液中的穩(wěn)定性 為獲得更準(zhǔn)確可靠的試驗(yàn)結(jié)果，參照Hu等[7]建立的方法采用液相色譜法測定了藻液中的雙唑草腈濃度變化。分析色譜條件為：色譜柱Inert SustainC18，4.6×150mm(i.d)不銹鋼柱，5μm；柱溫40℃ ；流動相為甲醇+水=55+45(V/V)；流速為1.00mL/min；進(jìn)樣量為20μL；波長為236nm。在上述色譜條件下，雙唑草腈的保留時(shí)間為7.80min，采用外標(biāo)法定量。設(shè)置1.00×10-2、5.00×10-2mg a.i./L濃度下2組添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，平均添加回收率為97.67%～98.45%，RSD為1.62%～1.82%，說明該方法符合檢測分析的基本要求，最低檢出量(LOD)為1.00×10-9g，最低檢出濃度(LOQ)為1.00×10-2mg a.i./L。

1.3.2 雙唑草腈對斜生柵藻的急性毒性 參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則》[9]和OECD[10]推薦的生長抑制法。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)定試驗(yàn)濃度分別為1.00×10-2、1.20×10-2、1.44×10-2、1.73×10-2、2.07×10-2、2.49×10-2mg a.i./L。在無菌條件下將雙唑草腈先用水生4號培養(yǎng)基溶液溶解、超聲、定容，分別得到兩倍上述濃度藥液50mL，再分別加入50mL濃度為 2.00×104cell/mL的藻液，振蕩混合均勻后于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天搖蕩3～5次，每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)空白對照組。于0、24、48、72h時(shí)取樣在顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)板測定各處理藻細(xì)胞數(shù)，并觀察其中毒癥狀，分別計(jì)算出藻細(xì)胞生物量半效應(yīng)濃度(EyC50)和藻細(xì)胞生長率半效應(yīng)濃度(ErC50)。

1.3.3 雙唑草腈對斜生柵藻光合色素的影響 參照熊麗等[11]和歐曉明等[12]的方法，并稍改進(jìn)。藻類培養(yǎng)液經(jīng)雙唑草腈暴露處理72h后，用移液管吸取藻細(xì)胞液30mL，4 000r/min離心10min，傾出上清液，直接加入5mL 80%(V/V)丙酮水溶液，搖勻，然后在光照培養(yǎng)箱中黑暗抽提12h，4 000r/min離心10min，取上清液于石英比色皿中，以80%丙酮溶液作為參比，用紫外可見分光光度儀分別測定藻細(xì)胞液在663nm、645nm和440nm波長下的吸光值，并按照公式(1)、(2)和(3)分別求出藻細(xì)胞葉綠素a(Ca)、葉綠素b(Cb)和類胡蘿卜素(Ck)含量(mg/L)。

Ca=12.7OD663-2.69OD645

(1)

Cb=22.9OD645-4.68OD663

(2)

Ck=4.70OD440-0.27(Ca+Cb)

(3)

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行整理和分析，以濃度的對數(shù)值作為自變量(x)，斜生柵藻的抑制率作為因變量(y)，建立劑量-效應(yīng)線性關(guān)系方程、計(jì)算EC50和95%置信區(qū)間；使用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析數(shù)據(jù)的顯著性，采用duncan檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙唑草腈在藻液中的穩(wěn)定性 試驗(yàn)期間各處理組藻細(xì)胞溶液中雙唑草腈的實(shí)測濃度(表1)?？瞻讓φ战M中未檢測出雙唑草腈，在暴露處理72h時(shí)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的雙唑草腈濃度為0h時(shí)的81.14～96.2%，偏差未超過20%，試驗(yàn)結(jié)果以0h和72h實(shí)測濃度的幾何平均值計(jì)[9-10]。

表1 試驗(yàn)起始和結(jié)束時(shí)雙唑草腈在溶液中的濃度變化

2.2 雙唑草腈對斜生柵藻的急性毒性 試驗(yàn)期間，與空白對照組相比，藻細(xì)胞溶液顏色隨雙唑草腈暴露處理時(shí)間延長而變淺變黃，高濃度組尤為明顯，說明雙唑草腈對藻細(xì)胞的生長具有不同程度的抑制作用，且該抑制作用與藥劑濃度呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性(圖1)。72h時(shí)，空白對照組中藻細(xì)胞濃度為1.38×106±3.06×104cell/mL。從藻細(xì)胞生物量分析，雙唑草腈對藻細(xì)胞生物量的抑制作用隨暴露濃度升高和時(shí)間延長而增強(qiáng)，當(dāng)暴露時(shí)間為72h時(shí)，各處理間抑制率差異顯著(p<0.05)，其對藻細(xì)胞生物量的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)，2.49×10-2mg a.i./L處理濃度組的生物量抑制率達(dá)到了90.79%(p<0.05)。從藻細(xì)胞生長率分析，72h時(shí)各處理間抑制率差異顯著(p<0.05)，但雙唑草腈對藻細(xì)胞生長率的抑制作用表現(xiàn)出與藻細(xì)胞生物量不同的現(xiàn)象，在暴露時(shí)間相同時(shí)，雙唑草腈對藻細(xì)胞生長率的抑制呈現(xiàn)隨濃度增大而增強(qiáng)的變化趨勢，而處理濃度相同時(shí)，雙唑草腈對藻細(xì)胞生長率的抑制作用隨時(shí)間延長并沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性變化。

圖中小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同圖1 雙唑草腈對斜生柵藻生長的抑制動態(tài)

根據(jù)生物量抑制率和生長抑制率數(shù)據(jù)，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行線性回歸分析，并求得雙唑草腈對藻細(xì)胞生物量或生長的EyC50或ErC50值，結(jié)果列于(表2)。除草劑雙唑草腈對斜生柵藻生長的抑制作用隨著時(shí)間推移而逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性，且相同暴露時(shí)間時(shí)雙唑草腈對斜生柵藻生物量的抑制作用強(qiáng)于對生長率的抑制。暴露時(shí)間為24、48和72h時(shí)，以生物量為指標(biāo)，雙唑草腈對斜生柵藻的EyC50值分別為2.07×10-2mg a.i./L、1.50×10-2mg a.i./L和1.38×10-2mg a.i./L，而以生長率為指標(biāo)，ErC50值分別為2.60×10-2mg a.i./L、2.45×10-2mg a.i./L和2.41×10-2mg a.i./L。

表2 雙唑草腈對斜生柵藻的急性毒性

2.3 雙唑草腈對斜生柵藻光合色素的影響 用不同系列濃度的雙唑草腈藥液處理斜生柵藻，經(jīng)暴露72h，取樣測定藻細(xì)胞中葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量，結(jié)果(圖2)和(表3)?？梢?，雙唑草腈對斜生柵藻光合色素的影響因光合色素種類而異。隨著雙唑草腈濃度的升高，藻細(xì)胞中葉綠素a、葉綠素b含量及其比值Ca/Cb均表現(xiàn)出不同程度的下降趨勢，其中對葉綠素a的影響具有顯著差異(p<0.05)，當(dāng)雙唑草腈的濃度為2.49×10-2mg a.i./L時(shí)，葉綠素a和葉綠素b受到的抑制作用最大，其抑制率分別為71.78%(p<0.05)和45.60%(p<0.05)，然而雙唑草腈對藻細(xì)胞中類胡蘿卜素的影響較小。說明雙唑草腈嚴(yán)重影響了斜生柵藻的光合作用，從而抑制了葉綠素a 和葉綠素b的生成，尤其是在葉綠素a值的變化更能很好地體現(xiàn)雙唑草腈的毒性抑制作用。

圖2 雙唑草腈對斜生柵藻光合色素的影響

表3 72h時(shí)雙唑草腈對光合色素的抑制動態(tài)

以雙唑草腈實(shí)測濃度的幾何平均值濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)(X)及其對葉綠素a、葉綠素b的抑制率為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸擬合，結(jié)果表明雙唑草腈與葉綠素a、葉綠素b之間均表現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。雙唑草腈對葉綠素a的抑制率的線性方程為Y=3.93x+6.98，R2=0.979，雙唑草腈對葉綠素a的72h-IC50為1.68×10-2mg a.i./L，95%置信區(qū)間為1.58×10-2～1.81×10-2mg a.i./L；雙唑草腈對葉綠素b的抑制率的線性方程為Y=2.14x+3.50，R2=0.923，雙唑草腈對葉綠素b的72h-IC50為2.33×10-2mg a.i./L，95%置信區(qū)間為1.99×10-2～3.18×10-2mg a.i./L。可見，雙唑草腈對葉綠素a的抑制作用要強(qiáng)于對葉綠素b的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)藥對藻類的毒性效應(yīng)主要由農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)決定，不同農(nóng)藥對藻類的毒性效應(yīng)不同，并在很大程度上表現(xiàn)為濃度相關(guān)性[3,12]。本研究表明不同濃度的雙唑草腈溶液中斜生柵藻生物量和藻細(xì)胞生長受到程度不同的抑制作用，且生長速率均低于空白組，同時(shí)雙唑草腈高濃度處理組(2.07×10-2、2.49×10-2mg a.i./L)還出現(xiàn)部分藻細(xì)胞體積增大、子細(xì)胞畸形分裂、人字形和褲型，2.49×10-2mg a.i./L處理中出現(xiàn)藻液脫色變黃等現(xiàn)象，這與前人報(bào)道的除草劑對藻類毒性效應(yīng)的研究結(jié)果一致[2,12-16]。本試驗(yàn)研究證實(shí)，以藻細(xì)胞生物量和生長率為指標(biāo)，參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》和OECD農(nóng)藥對藻類的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，雙唑草腈對斜生柵藻均表現(xiàn)為高毒。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，必須科學(xué)合理使用雙唑草腈除草劑，注意施藥方法和施藥量的控制，盡量避免其進(jìn)入水體，減少對水生生態(tài)環(huán)境的污染。

葉綠素是各種浮游藻類中廣泛存在的天然色素，其中葉綠素a存在于所有的浮游藻類中，大約占有機(jī)物干重的 1%～2%，是估算浮游植物生物量的重要指標(biāo)[2,17]，同時(shí)葉綠素含量也是客觀反映植物利用光照能力的一種重要指標(biāo)，往往作為判斷植物光合能力強(qiáng)弱，反映環(huán)境脅迫狀況的依據(jù)[2-3,12,16]。本研究證實(shí)雙唑草腈對斜生柵藻葉綠素a和葉綠素b具有明顯的抑制作用，其對葉綠素a的抑制作用明顯強(qiáng)于對葉綠素b的抑制作用，且葉綠素a與葉綠素b的比值隨著處理濃度升高而變小。在正常的細(xì)胞中，葉綠素a與葉綠素b的比值會維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，比值減小對植物的光合作用影響較大[18]，這應(yīng)該與雙唑草腈的作用方式有關(guān)，雙唑草腈作為一種觸殺型雙吡唑類除草劑，其通過植物組織中原卟啉原氧化酶積聚而發(fā)揮藥效[5]。原卟啉原氧化酶與細(xì)胞中葉綠素和血紅素的合成有關(guān)，當(dāng)此酶受到抑制后，便會導(dǎo)致葉綠素第一個(gè)吸收光的前體物質(zhì)原卟啉原IX的積累[19]，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后被氧化成原卟啉IX，進(jìn)一步代謝產(chǎn)生單線態(tài)氧，造成細(xì)胞膜等過氧化，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響葉綠素的合成和光合作用受阻[20]，導(dǎo)致藻細(xì)胞的生長受到抑制。因此，作者認(rèn)為葉綠素a不僅可以作為評價(jià)藻類生物量的重要指標(biāo)，還可作為藻類對農(nóng)藥等污染物敏感性強(qiáng)弱的毒性評價(jià)指標(biāo)。