祝啟海 夏國慶 宋 偉

垂體腺瘤大多源于垂體前葉，是顱內(nèi)常見的良性腫瘤，但部分垂體腺瘤可見海綿竇、硬腦膜、蝶篩竇等受累[1]。垂體腺瘤早期很難預(yù)測腫瘤侵襲發(fā)生風(fēng)險，通常在侵襲發(fā)生之后才能診斷，但往往錯過了全切除的機(jī)會，術(shù)后殘留風(fēng)險高[2]。目前，垂體腺瘤侵襲的機(jī)制尚未完全明確。近年來，研究指出腫瘤發(fā)生與基因異常表達(dá)等有關(guān)[3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中存在過表達(dá)，可能與腫瘤侵襲有關(guān)[4]。本文探討DCX 與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象①納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理證實為垂體腺瘤；年齡≥18歲；精神狀態(tài)正常；認(rèn)知功能、溝通能力良好。②排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他部位腫瘤；心、肝、腎等重要臟器受損；凝血功能障礙，不適宜行手術(shù)；患造血系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病。

2017年1月至2020年1月收治符合標(biāo)準(zhǔn)的垂體腺瘤88例，其中56例獲取瘤旁垂體組織。88例中，男48例，女40例；年齡20～74歲，平均（48.44±11.82）歲；腫瘤最大徑8～62 mm，平均（35.39±16.87）mm。內(nèi)分泌激素免疫組化分類：混合型19 例，生長激素型8 例，泌乳素型23 例，促腎上腺皮質(zhì)素型6 例，無功能型32例。

1.2 檢測方法

1.2.1 DCX的免疫組化檢測 標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，行石蠟包埋，切片厚度為1.5 μm。脫蠟入水，行抗原修復(fù)；利用PBS 洗滌3 次，3 min/次；加一抗，在37 ℃下孵育60 min，在室溫下反應(yīng)30 min，復(fù)溫；PBS洗滌2 次，3 min/次；加二抗，在37 ℃下反應(yīng)20 min；PBS洗滌2次，3 min/次；行DAB顯色，在避光條件下進(jìn)行觀察，1～3 min 內(nèi)終止顯色；蘇木素復(fù)染1 min；脫水、封片。免疫組化染色結(jié)果評估[5]：光學(xué)顯微鏡觀察，若細(xì)胞膜、細(xì)胞漿內(nèi)可見棕黃色則為陽性（圖1），至少選取5個高倍視野（×400），根據(jù)陽性細(xì)胞占比、染色強(qiáng)度計分：①陽性細(xì)胞占比≤5%、6%～25%、26%～50%、≥51%分別計0、1、2、3 分；②染色強(qiáng)度無染色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2、3 分。兩種計分乘積為最終計分結(jié)果，總分≤2分為陰性，≥3分為陽性。

圖1 雙皮激素免疫組化染色（SP法，×400）

1.2.2 微血管密度（microvessel density，MVD）的檢測采用免疫組化法測定，若血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)為棕黃或棕褐色，為FⅧAg 陽性細(xì)胞。利用低倍鏡（×100）對血管高密度區(qū)進(jìn)行選擇，經(jīng)高倍鏡（×200）選取3個視野，計算該區(qū)域內(nèi)MVD，以3個視野均值為最終結(jié)果。

1.2.3 qRT-PCR檢測DCX mRNA 利用TRizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行擴(kuò)增PCR。引物序列：① DCX 上 游 序 列 為 5'- TCCCCAACACCTCAAAAGAC-3'，下游序列為5'-TTTGTTAGACGAAGCTTGGGCTGCA-3'；②內(nèi)參GAPDH 上游序列為5'-GGCGATCTGGTGGAGTTCGT-3'，下游序列為5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'。反應(yīng)條件為94 ℃3 min，94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s，共35 個循環(huán)，72 ℃7 min。以2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。

1.3 垂體腺瘤侵襲性的評價 根據(jù)Knosp分類方法評估腫瘤侵襲性[6]。根據(jù)MRI掃描，將蝶鞍中段掃描平面視作參考平面，觀察海綿竇周圍顯影狀態(tài)，分成5個等級：0級，海綿竇未見侵犯，病灶處于頸內(nèi)動脈側(cè)壁連線內(nèi)；1級，內(nèi)側(cè)靜脈叢增強(qiáng)消失，病灶處于頸內(nèi)動脈內(nèi)切線與中切線之間；2級，內(nèi)側(cè)以及下方或上方靜脈叢增強(qiáng)部分消失，病灶處于頸內(nèi)動脈中切線、外切線之間；3級，內(nèi)側(cè)以及下方或上方靜脈叢增強(qiáng)完全消失，外側(cè)增強(qiáng)也可見部分消失，病灶超過頸內(nèi)動脈外切線：4級，靜脈叢增強(qiáng)徹底消失，腫瘤將頸內(nèi)動脈完全包裹。其中0、1級為無侵襲組，2～4級為侵襲組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件分析；計數(shù)資料行χ2檢驗；計量資料以x±s表示，行t檢驗；利用多因素logistic 回歸分析檢驗侵襲性的危險因素；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析DCX mRNA 水平預(yù)測腫瘤侵襲性的效能；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 垂體腺瘤組織DCX 表達(dá)情況 垂體腺瘤組織DCX 陽性率（71.59%，63/88）明顯高于瘤旁組織（17.86%，10/56；P＜0.05）。垂 體 腺 瘤 組 織DCX mRNA 表達(dá)量（5.65±1.87）明顯高于瘤旁組織（0.85±0.28；P＜0.05）。

2.2 垂體腺瘤發(fā)生侵襲性的影響因素 本文88 例垂體腺瘤中，侵襲組41 例，無侵襲組47 例。單因素分析顯示，MVD、DCX 表達(dá)水平與垂體腺瘤侵襲性有關(guān)（P＜0.05，表1）。多因素logistic 回歸分析顯示MVD≥28.68、DCX 表達(dá)陽性是垂體腺瘤發(fā)生侵襲的獨立危險因素（P＜0.05，表2）。

表1 垂體腺瘤發(fā)生侵襲性影響因素的單因素分析（例）

表2 垂體腺瘤發(fā)生侵襲性影響因素的多因素logistic 分析結(jié)果

2.3 DCX mRNA 表達(dá)量預(yù)測垂體腺瘤侵襲性的價值

侵襲組DCX mRNA 表達(dá)量（6.42±0.86）明顯高于無侵襲組（4.98±0.94；P＜0.05）。ROC 曲線顯示，DCX mRNA 表達(dá)量預(yù)測垂體腺瘤侵襲性的曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.775（95% CI 0.676～0.874；P＜0.001），最 佳 界 值 為5.640，敏 感 度 為78.00%，特異度為61.70%。見圖2。

圖2 ROC 曲線分析雙皮激素mRNA 表達(dá)量預(yù)測垂體腺瘤侵襲性的效能

3 討論

目前，垂體腺瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但基因異常表達(dá)等可能參與其進(jìn)展過程[7]。有學(xué)者指出抑癌基因活性喪失以及原癌基因活性增強(qiáng)與垂體腺瘤的發(fā)生有關(guān)[8]。侵襲性垂體腺瘤可導(dǎo)致海綿竇、顱骨、頸內(nèi)動脈等受累，手術(shù)風(fēng)險大，術(shù)后易復(fù)發(fā)，其侵襲過程涉及的機(jī)制較復(fù)雜[9]。研究認(rèn)為DCX與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，與微管結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞骨架系統(tǒng)處于松散狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞遷移[10]。本文結(jié)果顯示，垂體腺瘤組織DCX 表達(dá)水平明顯高于瘤旁組織。DCX是一種微管相關(guān)蛋白，在人腦多個部位存在表達(dá)，例如海馬齒狀回顆粒下層、腦室室管膜下區(qū)等。它的表達(dá)缺失可導(dǎo)致細(xì)胞遷移受阻，引起遷移過程紊亂，誘發(fā)智力障礙[11]。然而，DCX過表達(dá)也會引起疾病，例如它在腫瘤組織中呈過表達(dá)，可導(dǎo)致大量囊泡侵及機(jī)體，促進(jìn)生長椎膨脹，使細(xì)胞核加速運動，促進(jìn)細(xì)胞遷移，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[12]。有學(xué)者以前列腺癌小鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)正常前列腺、前列腺癌以及轉(zhuǎn)移病灶DCX 表達(dá)未見差異[13]。這表明DCX 在不同腫瘤中的表達(dá)可能存在特異性。

本文結(jié)果顯示MVD、DCX陽性表達(dá)與垂體腺瘤侵襲有關(guān)。MVD值反映腫瘤血管生成情況，該值越高提示腫瘤血管生成越明顯。腫瘤血管生成是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)條件，通常在腫瘤生長初期屬于無血管期。當(dāng)病灶體積長至1～2 mm3時，則可見血管生成，腫瘤細(xì)胞能夠釋放大量血管生成因子，促使血管形態(tài)發(fā)生變化，致腫瘤局部血管網(wǎng)絡(luò)形成，高侵襲性腫瘤大多可見豐富的血管網(wǎng)絡(luò)，與腫瘤細(xì)胞遷移密切相關(guān)[14]。DCX過表達(dá)與腫瘤侵襲也存在關(guān)聯(lián)，可能通過影響腫瘤細(xì)胞運動以及細(xì)胞骨架變化，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲[15]。本文ROC 曲線結(jié)果顯示，DCX mRNA 水平對垂體腺瘤侵襲性具有一定預(yù)測作用。

總之，垂體腺瘤DCX 呈高表達(dá)，檢測DCX 表達(dá)水平對判斷垂體腺瘤的侵襲性有一定的預(yù)測作用。