曾君瑞，潘力，王斌

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

β-淀 粉 酶 （α-1,4-D-glucan maltohydrolase，EC3.2.1.2），是一種外切型淀粉酶[1]，可以從糖原或淀粉的非還原性末端依次切割α-1,4糖苷鍵，因此β-淀粉酶作用于直鏈淀粉時(shí)，生成麥芽糖[2,3]，而作用于支鏈淀粉時(shí)，由于無(wú)法切割支鏈淀粉分支處的α-1,6糖苷鍵，生成麥芽糖和極限糊精[4-6]。植物來(lái)源的β-淀粉酶主要存在于胚乳中[7]，但制備工藝復(fù)雜，成本較高，原料受季節(jié)影響明顯，且酶質(zhì)量不穩(wěn)定；微生物來(lái)源的β-淀粉酶主要是芽孢桿菌[8,9]，如彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）[10]、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）[11]、多黏芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa）[12]、高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌（Clostridium thermosulfurogenes）[13]和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[14]，隨著發(fā)酵工藝逐漸成熟，易達(dá)到規(guī)模化生產(chǎn)，可以彌補(bǔ)植物來(lái)源的β-淀粉酶生產(chǎn)上不足，但現(xiàn)有報(bào)道表達(dá)水平整體不高，較高的是段緒果等[15]報(bào)道的β-淀粉酶酶活為925.40 U/mL，無(wú)法滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)需要，所以利用基因工程等手段表達(dá)和提高β-淀粉酶酶活水平成為研究學(xué)者關(guān)注的方向。

在啤酒釀造、制糖等工業(yè)的糖化反應(yīng)中，β-淀粉酶需要保持與協(xié)同使用酶相似的作用溫度和pH，以期最大程度提高麥芽糖轉(zhuǎn)化率，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)B.megaterium來(lái)源的β-淀粉酶具有很好的溫度耐受性和pH作用條件，滿(mǎn)足糖化反應(yīng)過(guò)程中偏酸性的要求，而其他來(lái)源的β-淀粉酶溫度耐受性不好，作用pH為中性偏堿性，僅有C.thermosulfurogenes來(lái)源的β-淀粉酶最適溫度為70 ℃，最適pH為6.0，因此B.megaterium是β-淀粉酶來(lái)源的理想菌株。微生物來(lái)源的β-淀粉酶在以枯草芽孢桿菌作為宿主表達(dá)時(shí)，酶活水平受調(diào)控元件-啟動(dòng)子和碳分解代謝物阻遏效應(yīng)（Carbon Catabolite Repression，CCR）的影響。啟動(dòng)子是提高外源蛋白表達(dá)水平的關(guān)鍵[16,17]，因此可通過(guò)篩選強(qiáng)啟動(dòng)子以及串聯(lián)單啟動(dòng)子，獲得活性較高的啟動(dòng)子；CCR效應(yīng)是指枯草芽孢桿菌在混合碳源環(huán)境發(fā)酵時(shí)，優(yōu)先利用速效碳源，且其產(chǎn)物會(huì)抑制其他非速效碳源代謝相關(guān)基因的表達(dá)[18,19]。CCR效應(yīng)中起關(guān)鍵作用的是分解代謝物控制蛋白（Catabolite control protein A，CcpA），該蛋白在 DNA上的順式調(diào)控元件稱(chēng)為分解代謝物響應(yīng)元件（Catabolite Responsive Element，CRE），CRE是14 bp的回文序列且高度保守[20]。通過(guò)定點(diǎn)突變CRE位點(diǎn)保守堿基，可使細(xì)胞內(nèi)阻遏復(fù)合物無(wú)法結(jié)合CRE位點(diǎn)，有效緩解CCR效應(yīng)[21]，減弱對(duì)菌體生長(zhǎng)和異源蛋白表達(dá)的抑制，從而提高β-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平。

本研究從B.megaterium基因組中擴(kuò)增β-淀粉酶基因，同時(shí)分析枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解鏈淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）轉(zhuǎn)錄組，選擇擴(kuò)增基因表達(dá)水平高的啟動(dòng)子，構(gòu)建含有不同啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到宿主B.subtilisATCC 6051?10中分泌表達(dá)，然后，通過(guò)基因編輯技術(shù)，定點(diǎn)突變CRE位點(diǎn)，提高β-淀粉酶的酶活水平，最后，將重組β-淀粉酶應(yīng)用在糖化反應(yīng)中，研究生成麥芽糖的轉(zhuǎn)化率，為β-淀粉酶的高效表達(dá)提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia colistellar，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis，解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，巨大芽孢桿菌Bacillus megateriumDSM 319，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisATCC 6051?10（SpoIIAC?、srfC?、aprE?、nprB?、nprE?、mpr?、vpr?、bpf?、epr?、wprA?），E.coli/ B.subtilispBE-穿梭載體，Amp+/Kan+，均為本實(shí)驗(yàn)室保存

1.1.2 試劑

Restriction Enzymes Fast Digest?購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；DreamTaq Green PCR Master Mix購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Prime STAR? HS DNA Polymerase（premix）購(gòu)于日本TaKaRa公司；HiFi DNA Assembly Cloning Kit試劑盒購(gòu)于美國(guó)NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購(gòu)于廣州捷倍斯生物科技有限公司；引物于上海生工有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉（固體含2%瓊脂）。

SOC培養(yǎng)基：31.4 g SOC固體粉末溶于1000 mL水，116 ℃高溫滅菌30 min。

LBS培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基，0.5 mol/L山梨醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基：1.5%蛋白胨，3%酵母提取物，1%氯化鈉，2%可溶性淀粉。

1.2 儀器

梯度PCR儀Veriti? 96-Well Thermal Cycler購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司；移液槍、離心機(jī)、電轉(zhuǎn)化儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；浸入式水平電泳系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó) BIO-RAD公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)NanoDrop 1000購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；M200多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于德國(guó)TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 單啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、克隆及轉(zhuǎn)化

1.3.1.1 pBE-AmyM表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及克隆

以B.megateriumDSM 319基因組為模板，設(shè)計(jì)特異性引物F-AmyM和R-AmyM（表1），由PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到β-淀粉酶基因（基因的C末段含6×His標(biāo)簽序列，基因序列見(jiàn)附表1），產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和膠回收。用XhoI和XbaI酶切pBE質(zhì)粒去除原有蛋白序列，膠回收載體片段，按照HiFi DNA Assembly Cloning Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，將載體和β-淀粉酶基因片段連接，將連接液轉(zhuǎn)化至E.colistellar感受態(tài)細(xì)胞，熱擊后加入SOC培養(yǎng)液復(fù)蘇1 h，吸取適當(dāng)復(fù)蘇液涂抗性LB固體平板（含Amp），37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，篩選驗(yàn)證正確后，送至測(cè)序公司測(cè)序，驗(yàn)證β-淀粉酶堿基序列。

表1 引物序列Table 1 List of primers

1.3.1.2 pBE-promoter-AmyM表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及克隆

以B.subtilis168基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到啟動(dòng)子 PB.S 168-aprE、PB.S 168-amy、PfusA、PgsiB、PyqfD、Ppgk、PsodA、PywzA、PgapA、Ptsf、PnprB、P43、PsrfA、Phag、Pveg、PydzA、PspovG片段，以B.licheniformis基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到啟動(dòng)子PB.liche-apr、PamyL片段，以B.amyloliquefaciens基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到啟動(dòng)子 PB.amy-apr、PamyQ、PsigW片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和膠回收。用EcoRI和SpeI酶切pBE-AmyM質(zhì)粒去除原有啟動(dòng)子序列，膠回收載體片段，分別連接啟動(dòng)子和載體片段，構(gòu)建pBE-promoter-AmyM表達(dá)質(zhì)粒（以pBE-PamyQ-AmyM為例），如圖1所示，并按照1.3.1.1的方法轉(zhuǎn)化至E.colistellar感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，篩選驗(yàn)證正確后，送至測(cè)序公司測(cè)序，驗(yàn)證啟動(dòng)子序列。

圖1 重組質(zhì)粒pBE-PamyQ-AmyM的構(gòu)建流程Fig.1 Construction of recombinant plasmid pBE-PamyQ-AmyM

1.3.1.3 pBE-promoter-AmyM 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)宿主Bacillus subtilisATCC 6051?10

將測(cè)序正確的 pBE-promoter-AmyM 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至宿主中，電轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[22]，取10 uL質(zhì)粒到B.subtilisATCC 6051?10感受態(tài)細(xì)胞中電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)結(jié)束后立即加入890 μL的LBS培養(yǎng)液，37 ℃孵育2~3 h后，將復(fù)蘇液涂布在抗性LB固體平板（含Kan），37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并提質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證質(zhì)粒和酶切片段大小，得到構(gòu)建成功的重組菌株 pBES01（PamyQ）、pBES02（PB.amy-apr）、pBES03（PamyL）、pBES04（PB.liche-apr）、pBES05（PB.S 168-amy）、pBES06（PB.S 168-aprE）、pBES07（PfusA）、pBES08（PgsiB）、pBES09（PyqfD）、pBES10（Ppgk）、pBES11（PsodA）、pBES12（PywzA）、pBES13（PgapA）、pBES14（Ptsf）、pBES15（PnprB）、pBES16（PsigW）、pBES17（P43）、pBES18（PsrfA）、pBES19（Phag）、pBES20（Pveg）、pBES21（PydzA）、pBES22（PspovG）。

1.3.2β-淀粉酶酶活力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[23]用3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）并做適當(dāng)調(diào)整：取0.94 mL用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制的 1%可溶性淀粉作為反應(yīng)底物（pH 6.0），于40 ℃預(yù)熱5 min，加0.06 mL酶液，混合均勻，40 ℃保溫15 min，取0.40 mL反應(yīng)液加1.20 mL DNS試劑，沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫，取0.20 mL加去離子水0.80 mL，混合均勻后于540 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。以標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液的不同濃度作為X軸，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)得反應(yīng)液的OD值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。一個(gè)酶活力單位（U）定義為：在pH 6.0、40 ℃條件下，每小時(shí)分解可溶性淀粉產(chǎn)生相當(dāng)于1 mg麥芽糖所需的酶量。

1.3.3 單啟動(dòng)子對(duì)β-淀粉酶表達(dá)水平的影響

選擇B.subtilisATCC 6051?10作為對(duì)照菌株，將pBES01-pBES22等22株重組菌接種至含有3 mL（24孔板）LB液體培養(yǎng)基中作為種子液，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌體濃度，按等生物量轉(zhuǎn)接至含有3 mL（48孔板）發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)30 h，取發(fā)酵液于4 ℃、12000 r/min離心15 min，測(cè)定上清液中β-淀粉酶酶活，篩選出10株高表達(dá)菌株。將篩選的菌株和作為對(duì)照的B.subtilisATCC 6051?10菌株，接種至含有50 mL（500 mL平底搖瓶）LB液體培養(yǎng)基中作為種子液，按照上述方法轉(zhuǎn)接至含有100 mL（500 mL擋板搖瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)，從21 h開(kāi)始每隔3 h取樣，測(cè)定上清液中β-淀粉酶酶活和菌體生長(zhǎng)量，篩選出高表達(dá)的單啟動(dòng)子重組菌株。

1.3.4 雙啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及對(duì)β-淀粉酶表達(dá)水平的影響

以篩選的單啟動(dòng)子重組菌株為模板，擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，構(gòu)建含有雙啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒pBED01（P43-P43）、pBED02（P43-PamyQ）、pBED03（P43-PsigW）、pBED04（ P43-PspovG）、 pBED05（ P43-PgsiB）、 pBED06（P43-PB.liche-apr）、pBED07（P43-PnprB），電轉(zhuǎn)化至宿主B.subtilisATCC 6051?10中，搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定上清液中β-淀粉酶酶活，篩選出高表達(dá)的雙啟動(dòng)子重組菌株。

1.3.5 突變型 AmyM-CRE表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及對(duì)β-淀粉酶表達(dá)水平的影響

以菌株pBED01為模板，按照表2所示，設(shè)計(jì)堿基突變引物，擴(kuò)增相應(yīng)片段，PCR反應(yīng)體系：質(zhì)粒（濃度 100 ng/μL 左右）2 μL，上下游引物各 2 μL，2×Prime STAR 25 μL，ddH2O 補(bǔ)足到總體積為 50 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)驗(yàn)證大小正確后，膠回收目的片段并測(cè)定濃度。按照1.3.1.1方法，把帶有突變位點(diǎn)的片段連接，將連接液轉(zhuǎn)化至E.colistellar感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證和測(cè)序，將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子電轉(zhuǎn)至宿主B.subtilisATCC 6051?10中，以pBED01菌株作為對(duì)照，搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定上清液中β-淀粉酶酶活。

表2 定點(diǎn)突變CRE位點(diǎn)的不同堿基Table 2 Site-directed mutation of different bases at CRE site

1.3.6 重組β-淀粉酶的純化和Western blot鑒定

重組β-淀粉酶純化采用鎳柱親和層析法[24]。重組β-淀粉酶帶有His標(biāo)簽與層析柱上的Ni2+發(fā)生螯合反應(yīng)而被吸附，從而得到純度較高的蛋白酶液。發(fā)酵上清液在4 ℃，12000 r/min離心15 min后，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，使用GE公司的5 mL HisTrap TMHP層析柱，采用10%梯度洗脫柱子，流速1.0 mL/min，收集有峰的洗脫液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)純化效果，并進(jìn)行Western blot特異性鑒定。

1.3.7 重組β-淀粉酶在糖化反應(yīng)過(guò)程中的應(yīng)用

將一定質(zhì)量的麥芽糊精烘干至恒重后，稱(chēng)取30 g溶于100 mL去離子水中，配置30%（W/V）的麥芽糊精溶液，為提高麥芽糖轉(zhuǎn)化率，使酶在最適條件下反應(yīng)，故調(diào)節(jié)麥芽糊精溶液pH為6.0，放入50 ℃恒溫水浴搖床中預(yù)熱后，分別加入重組β-淀粉酶50、100、200、400 U/g（干麥芽糊精），將反應(yīng)液倒入500 mL搖瓶中，置于50 ℃水浴搖床，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min，反應(yīng)48 h后，煮沸樣品終止反應(yīng)，按1:1比例加入色譜純乙腈，靜置沉淀2 h后，取上清液8000 r/min離心20 min，0.22 μm微孔膜過(guò)濾，通過(guò)HPLC檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)生麥芽糖的量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算麥芽糖轉(zhuǎn)化率。

色譜條件：色譜儀為 Waters 2695-2414，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，色譜柱為Aminex HPX-87H (Bio-Rad)，柱溫為60 ℃，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1β-淀粉酶基因克隆及序列分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到β-淀粉酶基因全長(zhǎng)1656 bp，共編碼551個(gè)氨基酸，其中有6個(gè)組氨酸和一個(gè)終止密碼子（β-淀粉酶基因序列見(jiàn)附件1），經(jīng)SignalP 4.1在線(xiàn)預(yù)測(cè)分析，表明該蛋白具有 N-端信號(hào)肽，其中1~20位為信號(hào)肽序列，β-淀粉酶分子量約為58 ku。經(jīng)比對(duì)β-淀粉酶基因編碼區(qū)存在 CRE位點(diǎn)：TGTTAACGCTTTCA，和高保守序列完全一致。

2.2 不同單啟動(dòng)子高效表達(dá)菌株的篩選

用XhoI和XbaI酶切得到pBE載體片段（圖2），大小為7351 bp，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證載體片段大小與預(yù)期一致，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到單啟動(dòng)子片段（圖2，以PsigW啟動(dòng)子為例，其余啟動(dòng)子電泳圖見(jiàn)附件2，啟動(dòng)子序列見(jiàn)附件 3），最后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證 pBE-Promoter-AmyM質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 pBE-AmyM載體片段與PCR擴(kuò)增片段電泳圖Fig.2 Electropherogram of pBE-AmyM and PCR products

將構(gòu)建成功的大腸桿菌菌株提質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)至宿主B.subtilisATCC 6051?10，接種發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)30 h后，測(cè)定上清液中β-淀粉酶酶活（圖3），可看出不同啟動(dòng)子介導(dǎo)β-淀粉酶酶活差異較大，其中 pBES01（PamyQ）、pBES03（PamyL）、pBES04（PB.liche-apr）、pBES08（PgsiB）、pBES15（PnprB）、pBES16（PsigW）、pBES17（P43）、pBES18（PsrfA）、pBES19（Phag）、pBES22（PspovG）菌株上清液中β-淀粉酶酶活高于其他啟動(dòng)子。

圖3 不同單啟動(dòng)子重組菌株酶活水平Fig.3 Enzyme activity levels of recombinant strains with single promoter

選取10株高表達(dá)菌株搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定上清液中β-淀粉酶酶活（圖4a）和菌體生長(zhǎng)量（圖4b），研究發(fā)現(xiàn)大部分菌株從24 h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，酶活水平大多在27 h時(shí)達(dá)到最高，其中由P43介導(dǎo)的菌株β-淀粉酶酶活可達(dá)到1165.82 U/mL，為單啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)的最高水平，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)酶活降低較快，這可能和σ因子有關(guān)，它是RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子序列的關(guān)鍵因子，啟動(dòng)子活力通過(guò)σ因子與生長(zhǎng)時(shí)期相關(guān)聯(lián)，B.subtilis168來(lái)源的胞苷脫氨酶啟動(dòng)子P43，是由σA和σB分別識(shí)別兩個(gè)重疊的-10區(qū)和-35區(qū)，啟動(dòng)強(qiáng)度對(duì)于多數(shù)目的蛋白較強(qiáng)，但其σ因子調(diào)控基因表達(dá)時(shí)期為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期和穩(wěn)定期，因此在穩(wěn)定前期 P43啟動(dòng)子介導(dǎo)的β-淀粉酶酶活最高，隨著菌體生長(zhǎng)到穩(wěn)定后期，則不再有轉(zhuǎn)錄活性，酶活表達(dá)水平開(kāi)始降低[25]。

圖4 單啟動(dòng)子重組菌株酶活水平以及菌體生長(zhǎng)量Fig.4 Enzyme activity expression levels of recombinant strains with single promoter and bacterial growth

2.3 不同雙啟動(dòng)子高效表達(dá)菌株的篩選

對(duì)重組菌株 pBE-P43-promoter-AmyM 分別在 27 h、30 h和33 h取上清液，測(cè)定β-淀粉酶酶活，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)：菌株 pBED01（P43-P43）酶活水平高于其他菌株（圖5a）；菌株pBED03（P43-PsigW）酶活水平在30 h達(dá)到最高，之后開(kāi)始降低（圖5b），說(shuō)明兩個(gè)啟動(dòng)子串聯(lián)表達(dá)時(shí)，會(huì)延長(zhǎng)蛋白酶表達(dá)的時(shí)間；雙啟動(dòng)子介導(dǎo)β-淀粉酶酶活水平明顯高于單啟動(dòng)子，但并無(wú)明顯規(guī)律，這可能和啟動(dòng)子的性質(zhì)以及目的蛋白有關(guān)系，不同的目的蛋白對(duì)啟動(dòng)子有一定的匹配度。

圖5 雙啟動(dòng)子重組菌株在27 h的酶活水平和在不同時(shí)間的酶活水平對(duì)比Fig.5 The enzyme activity level of recombinant strains with different dual-promoters at 27 h and the comparison of expression levels at different times

2.4 突變型AmyM-CRE表達(dá)菌株的篩選

定點(diǎn)突變CRE位點(diǎn)堿基，獲得五株突變菌株，搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定上清液中β-淀粉酶酶活（圖6）。由pBE01和pBE02可知，當(dāng)只突變不同位點(diǎn)的一個(gè)堿基時(shí)，兩株菌表達(dá)β-淀粉酶酶活水平相當(dāng)，由pBE03可知，當(dāng)突變兩個(gè)堿基位點(diǎn)時(shí)，β-淀粉酶酶活得到了進(jìn)一步提升，但當(dāng)突變?nèi)齻€(gè)和四個(gè)堿基之后，pBE03、pBE04和pBE05菌株β-淀粉酶酶活水平基本無(wú)變化，這可能是定點(diǎn)突變兩個(gè)高保守的CRE位點(diǎn)后，細(xì)胞內(nèi)阻遏復(fù)合物已不能與CRE位點(diǎn)結(jié)合，因此CCR效應(yīng)已在最大程度上得到緩解，β-淀粉酶酶活水平相較未突變前提高58.03%。

圖6 突變型菌株在27 h的酶活水平Fig.6 The expression level of enzyme activity of mutant strains at 27 h

2.5 重組β-淀粉酶純化和Western blot鑒定

對(duì)帶有His標(biāo)簽的重組β-淀粉酶發(fā)酵上清液處理后，進(jìn)行鎳柱親和層析純化（圖7a），并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳（圖7b），結(jié)果顯示存在單一的目的條帶，經(jīng)Western blot特異性鑒定（圖7c），結(jié)果顯示為一條特異性免疫反應(yīng)條帶，證明確為表達(dá)的目的蛋白β-淀粉酶。

圖7 重組β-淀粉酶純化圖譜、純化后的重組β-淀粉酶SDS-PAGE分析、Western blot特異性鑒定Fig.7 The process of purification of recombinant β-amylase、SDS-PAGE analysis and Western blot specific identification

2.6 重組β-淀粉酶在糖化過(guò)程中的應(yīng)用效果

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

用麥芽糖標(biāo)品配置濃度為 0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.6的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液的峰圖（圖8a），由色譜圖看出，麥芽糖出峰時(shí)間為7.08 min，色譜圖中無(wú)干擾峰，峰圖形狀標(biāo)準(zhǔn)，可用于定量分析樣品中麥芽糖含量，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可看出（圖8b），麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程為 y=69484x-796.72，R2=0.9998，線(xiàn)性關(guān)系較好。

圖8 麥芽糖標(biāo)品出峰圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.8 Peak diagram of maltose standard product and standard curve

2.6.2 重組β-淀粉酶不同加入量對(duì)麥芽糖轉(zhuǎn)化率的影響

隨著重組β-淀粉酶加入量的增加，麥芽糖轉(zhuǎn)化率在一定范圍內(nèi)呈升高趨勢(shì)，當(dāng)加酶量達(dá)到200 U/g時(shí)，麥芽糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高水平為57.62%，而當(dāng)加酶量繼續(xù)增大時(shí)，麥芽糖轉(zhuǎn)化率則不再繼續(xù)提高，這可能是底物麥芽糊精已經(jīng)消耗完全（圖9）。

圖9 樣品色譜圖和重組β-淀粉酶不同加入量對(duì)麥芽糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Chromatogram and the effect of different amounts of β-amylase on maltose conversion rate

3 結(jié)論

3.1 枯草芽孢桿菌作為宿主菌表達(dá)異源蛋白，技術(shù)比較成熟，菌株生長(zhǎng)特性強(qiáng)，蛋白分泌背景清晰，并且其獨(dú)特的內(nèi)源性代謝模式，提高了蛋白分泌加工效率，不產(chǎn)生包涵體，表達(dá)的蛋白直接分泌在胞外培養(yǎng)基中，簡(jiǎn)化蛋白下游加工分離純化程序，本實(shí)驗(yàn)采用的宿主B.subtilisATCC 6051?10是通過(guò)溫敏型質(zhì)粒pKS無(wú)痕敲除體系，對(duì)野生菌的10個(gè)基因進(jìn)行敲除，敲除的基因?qū)晟L(zhǎng)無(wú)影響，但有利于維持異源蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性，提高表達(dá)水平，并且在發(fā)酵過(guò)程中起泡較少[26]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇B.subtilisATCC 6051?10作為發(fā)酵菌株。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，芽孢桿菌的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄組水平上得到了深入的研究，利用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)可以高通量篩選表達(dá)水平高的強(qiáng)啟動(dòng)子，Martin等[27]研究也證實(shí)了啟動(dòng)子與其調(diào)控的基因水平間呈正相關(guān)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)基因的啟動(dòng)子，構(gòu)建重組菌株，調(diào)控β-淀粉酶表達(dá)水平。

3.2 本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建了22株單啟動(dòng)子和7株雙啟動(dòng)子介導(dǎo)β-淀粉酶表達(dá)的菌株，其中雙啟動(dòng)子P43-P43介導(dǎo)的重組菌株在搖瓶培養(yǎng)27 h時(shí)，β-淀粉酶酶活水平達(dá)到2950.76 U/mL，是單啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)的2.53倍，通過(guò)堿基突變，有效緩解碳代謝阻遏效應(yīng)，重組β-淀粉酶酶活水平最高可達(dá)到4663.03 U/mL，為β-淀粉酶工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論支持。

3.3 對(duì)重組β-淀粉酶進(jìn)行鎳柱親和層析純化和Western blot特異性鑒定，結(jié)果為單一目的條帶，證明β-淀粉酶表達(dá)成功，同時(shí)將重組β-淀粉酶應(yīng)用于糖化反應(yīng)中，得到麥芽糖轉(zhuǎn)化率為57.62%。綜上，本研究為重組β-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)，后續(xù)可以進(jìn)一步研究發(fā)酵條件的優(yōu)化，以得到更高表達(dá)的酶活水平。