黃竹珺，李茜，陳丹，樊竹青，羅銀玲，鄭琰*

（1.普洱學(xué)院 生物與化學(xué)學(xué)院，云南普洱 665000；2.云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南普洱 665000）

黃精是一類常用的滋補(bǔ)中藥材，在臨床上應(yīng)用較為廣泛。其中，黃精多糖在抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗疲勞等方面均顯示出潛在的藥用價值[1-4]。滇黃精在黃精品種中的產(chǎn)量及市場份額最大，是一種重要的“云藥”品種[5]。然而，隨著人們對黃精原料需求量的持續(xù)上升，黃精野生資源銳減，云南黃精市場份額從2010 年前的70%左右降至2018 年底的20%左右[6]。因此，對滇黃精中黃精多糖含量進(jìn)行測定，為發(fā)掘傳統(tǒng)中藥和更好地指導(dǎo)中藥材黃精的多糖質(zhì)量控制指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)建立提供理論依據(jù)，同時促使云南產(chǎn)區(qū)優(yōu)質(zhì)黃精得到大規(guī)模的開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 材料

采集玉溪、保山、昆明、普洱、紅河、昭通地區(qū)等11 個滇黃精樣本；無水葡萄糖對照品（100 mg/支），北京萊耀生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇，AR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蒽酮（≥98.0%），AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸，AR，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司；無水葡萄糖對照品（170604），含量≥99.0%，北京萬佳首化生物科技有限公司。

UV-2800A 紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；HH-W420 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動儀器廠；DHG-9245A 型鼓風(fēng)干燥箱，上?；厶﹥x器制造有限公司；FA3204B 電子分析天平，上海天美天平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，稀釋定容于100.00 mL 容量瓶中，制備得到質(zhì)量濃度為0.331 mg/mL 的葡萄糖對照品溶液。準(zhǔn)確移取梯度體積0.10 ～0.60 mL 的葡萄糖對照品溶液分別置于6 支10.00 mL 干燥的具塞刻度試管中，以蒸餾水作為空白對照，分別向各試管加蒸餾水至試管刻度2.00 mL 處，搖勻，先后依次在冰水浴中緩慢滴加0.2%的蒽酮-硫酸溶液8.00 mL，邊加邊輕輕搖勻至滴完，于恒溫水浴鍋中保溫10 min 發(fā)生顯色反應(yīng)，再置冰水浴中冷卻10 min，在試驗所確定的最佳波長624 nm 處進(jìn)行吸光度的測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 黃精多糖供試液制備方法的篩選

1.3.2.1 黃精多糖供試液的制備

精密稱量干燥恒重過3 號篩（50 目）的黃精樣品粉末適量于圓底燒瓶中，先后進(jìn)行兩次熱回流，第一次為80%乙醇，趁熱過濾，殘渣用80%熱乙醇淋洗3次，過濾后將所得殘渣及濾紙一并放入該燒瓶中，加入與乙醇體積相同的蒸餾水，進(jìn)行第二次熱回流，趁熱過濾，殘渣和燒瓶用熱的蒸餾水洗滌4 次，合并濾液，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用少量水多次洗滌盛裝濾液的抽濾瓶，轉(zhuǎn)移至容量瓶，加水定容，搖勻，即可得黃精多糖供試液。準(zhǔn)確量取1.00 mL 黃精多糖供試液于10.00 mL 干燥具塞刻度試管中，根據(jù)“1.3.1”進(jìn)行吸光度的測定，并根據(jù)公式（1）計算黃精多糖含量。

式中，C為黃精多糖供試液被稀釋后的質(zhì)量濃度，mg/mL；D為黃精多糖供試液的稀釋倍數(shù)；V為黃精多糖供試液的體積，mL；m為黃精樣品質(zhì)量，mg。

1.3.2.2 黃精多糖供試液制備方法的正交優(yōu)化篩選

如表1 所示，以過篩的藥材粒度大小、乙醇回流時間、水回流時間設(shè)計正交試驗方案，確定最佳的黃精多糖供試液制備條件。

表1 正交因素與水平表

1.3.3 滇黃精中黃精多糖的含量測定

根據(jù)正交優(yōu)化試驗所確定的最佳制備方法制取黃精多糖供試液，對11 個滇黃精樣本進(jìn)行黃精多糖含量的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=49.776x-0.103（R2=0.999 0），對照品溶液質(zhì)量濃度在3.31～19.86 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 黃精多糖供試液制備方法篩選結(jié)果

2.2.1 正交試驗結(jié)果

如表2 所示，藥材粒度（A）、乙醇回流時間（B）以及水回流時間（C）對黃精多糖的質(zhì)量濃度都有不同程度的影響，3 個因素對黃精多糖質(zhì)量濃度的影響程度大小依次為B ＞C ＞A。以黃精多糖含量的高低作為參考評價的指標(biāo)，由此得出黃精多糖供試液最佳制備方法為A1B2C3，即藥材粉碎至50 目，乙醇回流時間1.0 h，水回流時間1.5 h。通過9 個試驗得到的最佳組合為A1B2C2，需進(jìn)行驗證試驗。

表2 正交實驗結(jié)果（n=3）

2.2.2 驗證試驗及方法學(xué)考察

對最佳制備方法進(jìn)行驗證，測定3 組平行試驗，得到A1B2C3制備方法下黃精多糖含量平均值為9.895 6%，高于A1B2C2組合的黃精多糖含量，證明此工藝條件可重復(fù)進(jìn)行。在此工藝條件下，進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明：精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗的RSD值分別為0.35%、1.46%、1.26%；加標(biāo)回收率為98.92%，RSD值為1.99%。

2.3 滇黃精中黃精多糖含量測定結(jié)果

如表3 所示，測定了云南不同地區(qū)11 個滇黃精樣本的黃精多糖含量，其中文山馬關(guān)滇黃精多糖含量最高，普洱思茅港多糖含量最低，范圍在7.043 9%～10.317 1%，含量均在7.0%以上，符合《中國藥典》中對黃精多糖的含量標(biāo)準(zhǔn)要求[7]。

表3 黃精多糖含量測定結(jié)果（n=3）

測定過程中需要注意，蒽酮-硫酸顯色劑的配制必須現(xiàn)用現(xiàn)配，并且避免光照[8]。若配制后擱置時間過長會導(dǎo)致所測得數(shù)據(jù)偏小。除此之外，在配制過程中所用儀器必須干燥；要求在冰水浴條件下加入顯色劑，且加入顯色劑的速度不能過快，要緩慢滴加。

3 結(jié)論

云南省氣候條件適宜滇黃精的生長，可在適生區(qū)大力發(fā)展黃精種植，建立優(yōu)質(zhì)黃精種植基地，緩解黃精藥材資源緊缺，保護(hù)黃精資源，帶動地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。云南不同地區(qū)11 個滇黃精樣本黃精多糖含量存在差異，含量在7.043 9%～10.317 1%；過3 號篩（50目）、乙醇回流1.0 h、水回流1.5 h 為制備黃精多糖供試液的最佳條件。蒽酮-硫酸分光光度法簡單快捷、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性較好，適用于黃精多糖含量的測定。