張海毅，叢大鵬，李廣生，都紅芳

（1.威海職業(yè)學(xué)院 康養(yǎng)學(xué)院，山東威海 264200；2.威海人生藥業(yè)有限公司，山東威海 264200）

巖藻多糖又名巖藻聚糖硫酸酯，是一種具有多種生理功效的海藻活性物質(zhì)。巖藻多糖在很多海藻中都能獲得，且含量高、易提取、藥理作用比較多，因此，有望被開(kāi)發(fā)成為21 世紀(jì)的新藥原料[1]。以泡葉藻為原料，經(jīng)粉碎、提取、分離、濃縮、除雜和噴霧干燥等主要加工工藝，制得高純度的巖藻多糖原料藥（Active Pharmaceutical Ingredient，API），而多糖的含量測(cè)定是多糖類(lèi)藥物質(zhì)量控制中考察產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的項(xiàng)目，也是考察藥品穩(wěn)定性的依據(jù)[2]。

測(cè)定多糖含量的方法主要有蒽酮-硫酸法[3-4]、苯酚-硫酸法[5-8]、Dische 比色法[9-10]、次甲基藍(lán)比色法[11-12]和色譜法[13-16]等。其中，色譜法樣品前處理工序比較繁瑣，對(duì)儀器設(shè)備要求高，難以實(shí)現(xiàn)推廣；比色法簡(jiǎn)單易行，成本低，在多糖含量測(cè)定中得到廣泛應(yīng)用[17]。中國(guó)藥典規(guī)定海藻中多糖的含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸法[18]，而水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定巖藻多糖的含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[19]，目前尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)的巖藻多糖原料藥多糖含量的檢測(cè)方法。預(yù)實(shí)驗(yàn)嘗試采用蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法對(duì)巖藻多糖原料藥多糖含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)蒽酮-硫酸法測(cè)定結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于苯酚-硫酸法，不能準(zhǔn)確反映原料藥的多糖含量。

研究表明苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性較好且不受蛋白質(zhì)的影響，并且測(cè)定結(jié)果在60 min 內(nèi)比較穩(wěn)定[20-21]，在測(cè)定多糖含量方面優(yōu)于蒽酮-硫酸法[6,21-23]。因此，本文采用苯酚-硫酸法，按照《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定，對(duì)巖藻多糖原料藥中多糖含量的測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為巖藻多糖原料藥多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和新藥申報(bào)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及物料

苯酚（C6H5OH）、蒽酮（C14H10O），分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸（H2SO4），分析純，三明市三園化學(xué)試劑有限公司；巖藻糖對(duì)照品C6H12O5，批號(hào)112014-201902，純度95.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；巖藻多糖原料藥（批次分別為A-20190531-11-1、A-20190531-12-1、A-20200421-14-1），威海人生藥業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

WH-3 型微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；DF-101T 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上?？粕齼x器有限公司；TU-1901 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 50 g/L 苯酚溶液的配制

稱(chēng)取苯酚100 g（精確至0.01 g），加鋁片0.10 g和碳酸氫鈉0.05 g，常壓蒸餾，收集（180±2）℃餾分。稱(chēng)取該餾分5 g（精確至0.01 g），置100 mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾至棕色試劑瓶中，置4 ℃冰箱中貯存[6]。

1.3.2 對(duì)照品溶液的配制

稱(chēng)取巖藻糖對(duì)照品0.05 g（精確至0.0001 g），加少量水溶解，溶液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，置4 ℃冰箱中避光貯存。

1.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)對(duì)照品溶液的配制

稱(chēng)取巖藻糖對(duì)照品0.02 g（精確至0.0001 g），加少量水溶解，溶液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，置4 ℃冰箱中避光貯存。

1.3.4 供試品溶液的配制

稱(chēng)取供試品0.01 g（精確至0.0001 g），用水溶解并定容至100 mL 容量瓶中，揺勻。

1.3.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別精密吸取對(duì)照品和A-20190531-11-1 供試品溶液1 mL 置比色管中，加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL，渦旋混勻，然后立即加入濃硫酸5.0 mL（與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便反應(yīng)液充分混合），渦旋混勻，沸水浴20 min，冷卻至室溫。另取蒸餾水同法操作作為空白對(duì)照，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在400 ～600 nm 范圍內(nèi)掃描獲得吸收曲線(xiàn)，獲得最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.6 多糖測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.6.1 線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液適量，加水逐級(jí)稀釋?zhuān)渲?成 濃 度 為0 μg/mL、25.0 μg/mL、62.5 μg/mL、125.0 μg/mL、250 μg/mL、375.0 μg/mL 和500.0 μg/mL的巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL 置比色管中，照“1.3.5”項(xiàng)下方法，自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起，同法處理，在最大吸收波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.6.2 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6 份A-20190531-11-1 供試品溶液，取1 mL 置比色管中，照“1.3.5”項(xiàng)下方法，自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起，同法處理，在最大吸收波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

1.3.6.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密吸取重現(xiàn)性試驗(yàn)對(duì)照品溶液適量，加水逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹? μg/mL、22.0 μg/mL、65.0 μg/mL、125.0 μg/mL、150.0 μg/mL 和200.0 μg/mL的巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。照“1.3.6.1”項(xiàng)下方法，自“取1 mL 置比色管中”起，同法處理，在最大吸收波長(zhǎng)處由兩名操作人員在不同實(shí)驗(yàn)室，用不同的儀器測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

平行制備兩份A-20190531-11-1 供試品溶液，由兩名操作人員在不同實(shí)驗(yàn)室，用不同的儀器進(jìn)行測(cè)定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

1.3.6.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱(chēng)取A-20190531-11-1 供試品0.01 g（精確至0.000 1 g），置100 mL 容量瓶中，制備9 份待用。分別精密吸取對(duì)照品溶液10 mL、20 mL、30 mL 置上述容量瓶中，進(jìn)行低、中、高3 個(gè)水平的加標(biāo)，每個(gè)濃度重復(fù)3 份，加水溶解并定容，揺勻。取1 mL 置比色管中，照“1.3.5”項(xiàng)下方法，自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起，同法處理，在最大吸收波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

1.3.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

平行制備兩份A-20190531-11-1 供試品溶液，在室溫下放置0 天、1 天、2 天、3 天后測(cè)定。取1 mL置比色管中，照“1.3.5”項(xiàng)下方法，自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起，同法處理，在最大吸收波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

1.3.7 樣品測(cè)定

照“1.3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定3 批巖藻多糖原料藥供試品中多糖的含量，每批2個(gè)平行。取1 mL 置比色管中，照“1.3.5”項(xiàng)下方法，自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起，同法處理，在最大吸收波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同一樣品重復(fù)測(cè)量3 次，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

巖藻糖對(duì)照品和A-20190531-11-1 供試品經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后，于400 ～600 nm 范圍內(nèi)掃描獲得吸收曲線(xiàn)（圖1）。結(jié)果顯示，巖藻糖對(duì)照品在λ=478 nm 處有最大吸收（圖1（b）），而供試品在λ=480 nm 處有最大吸收（圖1（a）），兩者最大吸收峰的波長(zhǎng)非常接近，符合藥典規(guī)定試樣的最大吸收波長(zhǎng)允許誤差范圍（±2 nm）[24]?？紤]到對(duì)照品在409 nm 和440 nm 波長(zhǎng)也有吸收峰，所以選擇測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為480 nm，其他方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)均在480 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。

圖1 巖藻糖供試品（a）和對(duì)照品（b）紫外掃描圖譜

2.2 多糖測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn)

以吸光度A為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（見(jiàn)圖2）。結(jié)果表明，巖藻糖含量在0 ～500 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為A=0.002C-0.005 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

圖2 巖藻糖含量與吸光度之間的關(guān)系

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取A-20190531-11-1 供試品，平行進(jìn)行6 次測(cè)定，計(jì)算RSD值，見(jiàn)表1。結(jié)果表明，供試品溶液平均多糖含量為87.30%，RSD值小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和A-20190531-11-1 供試品，由2 名操作人員，在不同的實(shí)驗(yàn)室，用不同的儀器進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3 和表2。

考慮到相同巖藻糖濃度下紫外分光光度計(jì)吸光度高于酶標(biāo)儀吸光度，所以重現(xiàn)性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制過(guò)程中，將巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍縮小為0 ～200 μg/mL。從圖3 可以看出，采用2 種操作方式進(jìn)行試驗(yàn)，巖藻糖含量在0 ～200 μg/ml 濃度范圍內(nèi)均與吸光度呈現(xiàn)良好線(xiàn)性關(guān)系，R2≥0.999 8。供試品重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表2），RSD值在4%以?xún)?nèi)，重現(xiàn)性良好。

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)供試品測(cè)定結(jié)果

圖3 重現(xiàn)性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較

研究發(fā)現(xiàn)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀在可見(jiàn)光區(qū)（400 nm 以上）的含量測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著差異，在可見(jiàn)光區(qū)酶標(biāo)儀是紫外分光光度計(jì)的理想替代工具[25]。由于巖藻多糖原料藥供試品批次較多，酶標(biāo)儀速度快，效率高，大大減少了勞動(dòng)強(qiáng)度，所以在多糖含量的測(cè)定過(guò)程中均采用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

準(zhǔn)確度系指用所建立方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度，一般用回收率表示。準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，供試品加樣回收率均在95%～102%范圍內(nèi)，平均回收率為98.37%，RSD值小于2%，表明該方法回收率較好，準(zhǔn)確度較高。

表3 供試品加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試品溶液穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表4，RSD值在2.0%以?xún)?nèi)，表明供試品溶液在室溫下72 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品測(cè)定

取3 批巖藻多糖原料藥供試品進(jìn)行多糖含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。每批供試品測(cè)定相對(duì)偏差均小于5.0%，樣品測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

表5 供試品含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

本研究參照《中國(guó)藥典》（2020 年版）四部9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，以巖藻糖為對(duì)照品，建立了酶標(biāo)儀法測(cè)定巖藻多糖原料藥多糖含量檢測(cè)方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法線(xiàn)性關(guān)系良好，具有較好的精密度和穩(wěn)定性，回收率較高，可準(zhǔn)確、穩(wěn)定的應(yīng)用于巖藻多糖原料藥多糖含量的檢測(cè)，后續(xù)研究將對(duì)巖藻多糖原料藥的單糖組成進(jìn)行分析，為巖藻多糖原料藥的質(zhì)量控制提供有益的參考依據(jù)。