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        巖藻多糖原料藥多糖含量測定方法的研究

        2021-09-02 05:53:24張海毅叢大鵬李廣生都紅芳
        生物化工 2021年4期
        關(guān)鍵詞:酶標(biāo)儀巖藻原料藥

        張海毅,叢大鵬,李廣生,都紅芳

        (1.威海職業(yè)學(xué)院 康養(yǎng)學(xué)院,山東威海 264200;2.威海人生藥業(yè)有限公司,山東威海 264200)

        巖藻多糖又名巖藻聚糖硫酸酯,是一種具有多種生理功效的海藻活性物質(zhì)。巖藻多糖在很多海藻中都能獲得,且含量高、易提取、藥理作用比較多,因此,有望被開發(fā)成為21 世紀(jì)的新藥原料[1]。以泡葉藻為原料,經(jīng)粉碎、提取、分離、濃縮、除雜和噴霧干燥等主要加工工藝,制得高純度的巖藻多糖原料藥(Active Pharmaceutical Ingredient,API),而多糖的含量測定是多糖類藥物質(zhì)量控制中考察產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的項(xiàng)目,也是考察藥品穩(wěn)定性的依據(jù)[2]。

        測定多糖含量的方法主要有蒽酮-硫酸法[3-4]、苯酚-硫酸法[5-8]、Dische 比色法[9-10]、次甲基藍(lán)比色法[11-12]和色譜法[13-16]等。其中,色譜法樣品前處理工序比較繁瑣,對儀器設(shè)備要求高,難以實(shí)現(xiàn)推廣;比色法簡單易行,成本低,在多糖含量測定中得到廣泛應(yīng)用[17]。中國藥典規(guī)定海藻中多糖的含量測定采用蒽酮-硫酸法[18],而水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定巖藻多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法[19],目前尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)的巖藻多糖原料藥多糖含量的檢測方法。預(yù)實(shí)驗(yàn)嘗試采用蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法對巖藻多糖原料藥多糖含量進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)蒽酮-硫酸法測定結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于苯酚-硫酸法,不能準(zhǔn)確反映原料藥的多糖含量。

        研究表明苯酚-硫酸法測定多糖含量方法簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性較好且不受蛋白質(zhì)的影響,并且測定結(jié)果在60 min 內(nèi)比較穩(wěn)定[20-21],在測定多糖含量方面優(yōu)于蒽酮-硫酸法[6,21-23]。因此,本文采用苯酚-硫酸法,按照《中國藥典》相關(guān)規(guī)定,對巖藻多糖原料藥中多糖含量的測定方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,為巖藻多糖原料藥多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和新藥申報(bào)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試劑及物料

        苯酚(C6H5OH)、蒽酮(C14H10O),分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸(H2SO4),分析純,三明市三園化學(xué)試劑有限公司;巖藻糖對照品C6H12O5,批號112014-201902,純度95.9%,中國食品藥品檢定研究院;巖藻多糖原料藥(批次分別為A-20190531-11-1、A-20190531-12-1、A-20200421-14-1),威海人生藥業(yè)有限公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

        WH-3 型微型旋渦混合儀,上海滬西分析儀器廠有限公司;DF-101T 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,上??粕齼x器有限公司;TU-1901 型紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Multiskan FC 酶標(biāo)儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 50 g/L 苯酚溶液的配制

        稱取苯酚100 g(精確至0.01 g),加鋁片0.10 g和碳酸氫鈉0.05 g,常壓蒸餾,收集(180±2)℃餾分。稱取該餾分5 g(精確至0.01 g),置100 mL 容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,過濾至棕色試劑瓶中,置4 ℃冰箱中貯存[6]。

        1.3.2 對照品溶液的配制

        稱取巖藻糖對照品0.05 g(精確至0.0001 g),加少量水溶解,溶液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,置4 ℃冰箱中避光貯存。

        1.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)對照品溶液的配制

        稱取巖藻糖對照品0.02 g(精確至0.0001 g),加少量水溶解,溶液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,置4 ℃冰箱中避光貯存。

        1.3.4 供試品溶液的配制

        稱取供試品0.01 g(精確至0.0001 g),用水溶解并定容至100 mL 容量瓶中,揺勻。

        1.3.5 檢測波長的確定

        分別精密吸取對照品和A-20190531-11-1 供試品溶液1 mL 置比色管中,加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL,渦旋混勻,然后立即加入濃硫酸5.0 mL(與液面垂直加入,勿接觸試管壁,以便反應(yīng)液充分混合),渦旋混勻,沸水浴20 min,冷卻至室溫。另取蒸餾水同法操作作為空白對照,用紫外可見分光光度計(jì)在400 ~600 nm 范圍內(nèi)掃描獲得吸收曲線,獲得最大吸收波長。

        1.3.6 多糖測定方法學(xué)驗(yàn)證

        1.3.6.1 線性關(guān)系試驗(yàn)

        精密吸取對照品溶液適量,加水逐級稀釋,配制 成 濃 度 為0 μg/mL、25.0 μg/mL、62.5 μg/mL、125.0 μg/mL、250 μg/mL、375.0 μg/mL 和500.0 μg/mL的巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL 置比色管中,照“1.3.5”項(xiàng)下方法,自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起,同法處理,在最大吸收波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),以對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.6.2 重復(fù)性試驗(yàn)

        平行制備6 份A-20190531-11-1 供試品溶液,取1 mL 置比色管中,照“1.3.5”項(xiàng)下方法,自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起,同法處理,在最大吸收波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

        1.3.6.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

        精密吸取重現(xiàn)性試驗(yàn)對照品溶液適量,加水逐級稀釋,配制成濃度為0 μg/mL、22.0 μg/mL、65.0 μg/mL、125.0 μg/mL、150.0 μg/mL 和200.0 μg/mL的巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。照“1.3.6.1”項(xiàng)下方法,自“取1 mL 置比色管中”起,同法處理,在最大吸收波長處由兩名操作人員在不同實(shí)驗(yàn)室,用不同的儀器測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),以對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        平行制備兩份A-20190531-11-1 供試品溶液,由兩名操作人員在不同實(shí)驗(yàn)室,用不同的儀器進(jìn)行測定,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

        1.3.6.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

        稱取A-20190531-11-1 供試品0.01 g(精確至0.000 1 g),置100 mL 容量瓶中,制備9 份待用。分別精密吸取對照品溶液10 mL、20 mL、30 mL 置上述容量瓶中,進(jìn)行低、中、高3 個(gè)水平的加標(biāo),每個(gè)濃度重復(fù)3 份,加水溶解并定容,揺勻。取1 mL 置比色管中,照“1.3.5”項(xiàng)下方法,自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起,同法處理,在最大吸收波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

        1.3.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        平行制備兩份A-20190531-11-1 供試品溶液,在室溫下放置0 天、1 天、2 天、3 天后測定。取1 mL置比色管中,照“1.3.5”項(xiàng)下方法,自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起,同法處理,在最大吸收波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

        1.3.7 樣品測定

        照“1.3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測定3 批巖藻多糖原料藥供試品中多糖的含量,每批2個(gè)平行。取1 mL 置比色管中,照“1.3.5”項(xiàng)下方法,自“加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL”起,同法處理,在最大吸收波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中相當(dāng)于巖藻糖的含量。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,采用酶標(biāo)儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn),同一樣品重復(fù)測量3 次,結(jié)果以平均值表示。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 檢測波長的確定

        巖藻糖對照品和A-20190531-11-1 供試品經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后,于400 ~600 nm 范圍內(nèi)掃描獲得吸收曲線(圖1)。結(jié)果顯示,巖藻糖對照品在λ=478 nm 處有最大吸收(圖1(b)),而供試品在λ=480 nm 處有最大吸收(圖1(a)),兩者最大吸收峰的波長非常接近,符合藥典規(guī)定試樣的最大吸收波長允許誤差范圍(±2 nm)[24]。考慮到對照品在409 nm 和440 nm 波長也有吸收峰,所以選擇測定最大吸收波長為480 nm,其他方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)均在480 nm 波長處進(jìn)行測定。

        圖1 巖藻糖供試品(a)和對照品(b)紫外掃描圖譜

        2.2 多糖測定方法學(xué)驗(yàn)證

        2.2.1 線性關(guān)系試驗(yàn)

        以吸光度A為縱坐標(biāo),以對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)。結(jié)果表明,巖藻糖含量在0 ~500 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,線性方程為A=0.002C-0.005 7,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

        圖2 巖藻糖含量與吸光度之間的關(guān)系

        2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

        取A-20190531-11-1 供試品,平行進(jìn)行6 次測定,計(jì)算RSD值,見表1。結(jié)果表明,供試品溶液平均多糖含量為87.30%,RSD值小于2.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

        表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

        2.2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

        取巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和A-20190531-11-1 供試品,由2 名操作人員,在不同的實(shí)驗(yàn)室,用不同的儀器進(jìn)行測定,結(jié)果見圖3 和表2。

        考慮到相同巖藻糖濃度下紫外分光光度計(jì)吸光度高于酶標(biāo)儀吸光度,所以重現(xiàn)性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程中,將巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍縮小為0 ~200 μg/mL。從圖3 可以看出,采用2 種操作方式進(jìn)行試驗(yàn),巖藻糖含量在0 ~200 μg/ml 濃度范圍內(nèi)均與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,R2≥0.999 8。供試品重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果表明(見表2),RSD值在4%以內(nèi),重現(xiàn)性良好。

        表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)供試品測定結(jié)果

        圖3 重現(xiàn)性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線比較

        研究發(fā)現(xiàn),紫外可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀在可見光區(qū)(400 nm 以上)的含量測定結(jié)果沒有顯著差異,在可見光區(qū)酶標(biāo)儀是紫外分光光度計(jì)的理想替代工具[25]。由于巖藻多糖原料藥供試品批次較多,酶標(biāo)儀速度快,效率高,大大減少了勞動(dòng)強(qiáng)度,所以在多糖含量的測定過程中均采用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

        2.2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

        準(zhǔn)確度系指用所建立方法測定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度,一般用回收率表示。準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見表3,供試品加樣回收率均在95%~102%范圍內(nèi),平均回收率為98.37%,RSD值小于2%,表明該方法回收率較好,準(zhǔn)確度較高。

        表3 供試品加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

        2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        供試品溶液穩(wěn)定性結(jié)果見表4,RSD值在2.0%以內(nèi),表明供試品溶液在室溫下72 h 內(nèi)穩(wěn)定。

        表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

        2.3 樣品測定

        取3 批巖藻多糖原料藥供試品進(jìn)行多糖含量測定,結(jié)果見表5。每批供試品測定相對偏差均小于5.0%,樣品測定結(jié)果穩(wěn)定。

        表5 供試品含量測定結(jié)果

        3 結(jié)語

        本研究參照《中國藥典》(2020 年版)四部9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則,以巖藻糖為對照品,建立了酶標(biāo)儀法測定巖藻多糖原料藥多糖含量檢測方法,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,該方法線性關(guān)系良好,具有較好的精密度和穩(wěn)定性,回收率較高,可準(zhǔn)確、穩(wěn)定的應(yīng)用于巖藻多糖原料藥多糖含量的檢測,后續(xù)研究將對巖藻多糖原料藥的單糖組成進(jìn)行分析,為巖藻多糖原料藥的質(zhì)量控制提供有益的參考依據(jù)。

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