鐘婷婷，郭詩芬，盧文斌，肖 鋼，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

根腫菌屬原生動(dòng)物界(Protozoa)，根腫菌綱(Plasmodiophoromycetes)，根腫菌目(Plasmodiophorales)，根腫菌屬(Plasmodiophora)，對(duì)油菜、甘藍(lán)等多種十字花科作物危害嚴(yán)重，調(diào)查表明田間受根腫病危害的油菜發(fā)病較輕減產(chǎn)30%左右，嚴(yán)重田塊可造成油菜絕收[1]。根腫菌休眠孢子的抗逆性強(qiáng)，可在土壤中存活數(shù)十年之久，主要為害十字花科植物根部，其根表皮薄壁細(xì)胞受到根腫菌刺激后大量分裂和膨大，呈大小不一形狀不規(guī)則的腫瘤[2]；從微觀層面上講，寄主植物的一些正常生理代謝受到影響[3]，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid)、細(xì)胞分裂素(Cytokinin)、糖類(Carbohydrate)以及蛋白質(zhì)(Protein)，隨即產(chǎn)生腫根。研究學(xué)者們對(duì)蕪菁、甘藍(lán)、蘿卜等資源進(jìn)行篩選鑒定后獲得部分抗病信息：蕪菁(Brassica.rapa，AA，2n=20)根腫病抗性是由單顯性基因控制的數(shù)量性狀遺傳[4]，具有小種特異性。甘藍(lán)(Brassicaoleracea，CC，2n=18)根腫病抗性是由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，且多為隱性遺傳，抗感范圍廣、遺傳規(guī)律較為復(fù)雜，由于不同定位研究使用不同的根腫病抗性源及不同的蕓薹根腫菌分離株，導(dǎo)致定位起來比較困難。蘿卜(Raphanussativus)根腫病抗性普遍較強(qiáng)，大部分蘿卜品種對(duì)根腫病抗病性可能是由單個(gè)顯性位點(diǎn)控制，受顯性主效基因控制，同時(shí)還可能存在其他微效抗性基因[5]。胡靖鋒等[6]通過抗根腫病蘿卜胞質(zhì)不育系和甘藍(lán)自交系雜交，獲得抗根腫病AACC型染色體甘藍(lán)型油菜材料ZZCZ13000。部分抗病基因已在育種中廣泛應(yīng)用：華中農(nóng)大選育出首批具有應(yīng)用價(jià)值的抗根腫病甘藍(lán)型油菜(B.napusL.AACC，2n=38)雜交新品種華油雜62R(含抗4號(hào)生理小種抗病位點(diǎn)CRb)和常規(guī)新品種華雙5R(含抗4號(hào)生理小種抗病位點(diǎn)PbBa8.1)，對(duì)根腫病4號(hào)生理小種具有免疫抗性，為我國(guó)育種家提供了新材料。

隨著后基因組時(shí)代的到來，第三代分子標(biāo)記SNP應(yīng)運(yùn)而生。由LGC(Laboratory of the Government Chemist 英國(guó)政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室)開發(fā)的競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)基因分型技術(shù)，可以對(duì)SNP和特定位點(diǎn)上的InDel進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因判斷，基于自己獨(dú)特的ARMSPCR原理實(shí)現(xiàn)SNP分型，SNP在基因組中具有分布密度高、突變率低、二態(tài)性高、穩(wěn)定性好、易于進(jìn)行高通量自動(dòng)化分析等特點(diǎn)[7]，在水稻、小麥等作物性狀基因的精細(xì)定位、分子輔助育種、種子資源鑒定等方面發(fā)揮重要作用。Han等[8]利用雄性不育突變體位點(diǎn)Ms-cd1開發(fā)的KASP標(biāo)記，成為甘藍(lán)Ms-cd1開發(fā)的首批KASP標(biāo)記。張強(qiáng)等[9]利用KASP標(biāo)記鑒定辣椒細(xì)胞質(zhì)類型，為辣椒三系雜交育種的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。Yang等[10]基于KASP標(biāo)記技術(shù)將種質(zhì)群體劃分為秈型和粳型2個(gè)亞群體，有效地維護(hù)和利用水稻遺傳資源。Fang等[11]利用六倍體小麥抗葉銹病基因Lr34第11外顯子和第22外顯子等位變異SNP位點(diǎn)開發(fā)的KASP標(biāo)記，能加速小麥Lr34的篩選。Devran等[12]針對(duì)抗番茄斑萎病原菌Sw-5基因座開發(fā)了KASP標(biāo)記，并在多個(gè)具有不同遺傳背景的番茄基因型中進(jìn)行驗(yàn)證，能成功篩選番茄斑萎病純合子抗性植株、雜合子抗性植株和感病品種植株。

Crr1基因來源于歐洲飼料蘿卜Siloga，目前已經(jīng)從Siloga中鑒定出Crr1、Crr2和Crr43個(gè)抗病基因，分別位于A08、A01和A06染色體上，對(duì)根腫病4號(hào)生理小種具有抗性。對(duì)Crr1基因精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)：Crr1可能包含2個(gè)基因位點(diǎn)，一個(gè)主要的根腫病抗性基因位點(diǎn)Crr1a和另一個(gè)作用較小的次要基因位點(diǎn)Crr1b[13]，其中Crr1a編碼TIR-NB-LRR抗病蛋白。Hatakeyama等[14]和Suwabe等[15]研究發(fā)現(xiàn)Crr2基因是Crr1和Crr4基因表達(dá)的增強(qiáng)劑，也就是說，只有與Crr2基因相互作用時(shí)，Crr1和Crr4才能對(duì)4號(hào)生理小種產(chǎn)生抗性。我國(guó)對(duì)根腫病的研究起步較晚，基于根腫病基因的KASP標(biāo)記研究還不多，本試驗(yàn)中抗性親本華雙5R含有從蕪菁轉(zhuǎn)育來的抗病位點(diǎn)PbBa8.1，該位點(diǎn)包含一個(gè)抗病基因Crr1[16]。甘藍(lán)型油菜(B.napusL.AACC，2n=38)基因組中LOC103834349基因與蕪菁Crr1基因有較高的同源性，本研究對(duì)抗病親本華雙5R的Crr1基因與感病親本LOC103834349基因進(jìn)行克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)部分SNP位點(diǎn)，針對(duì)第1486-1487上的非同義突變位點(diǎn)，開發(fā)了一套精準(zhǔn)檢測(cè)自交后代抗根腫病基因型的KASP分子標(biāo)記，能夠快速精準(zhǔn)檢測(cè)抗感甘藍(lán)型油菜的基因型，大幅提高了甘藍(lán)型油菜根腫病抗性育種效率。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗性親本材料甘藍(lán)型油菜華雙5R(含根腫病4號(hào)生理小種抗病位點(diǎn)PbBa8.1，來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種研究所油菜研究室)為供體親本。25個(gè)農(nóng)藝性狀好，含油量在48%～54%，油酸含量在70%～78%的甘藍(lán)型油菜自交系(來自水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)為受體親本進(jìn)行雜交獲得F1，F(xiàn)1后代經(jīng)過自交獲得F2群體。2020年10月13日將42個(gè)F2群體播種在上一年根腫病發(fā)病嚴(yán)重的田塊中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間表型鑒定 材料種植地上一年根腫病發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率95%左右。播種前利用根腫菌18S rRNA特異引物對(duì)田間土壤病菌孢子含量進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定，孢子數(shù)為5.1×103～104個(gè)/g。田間鑒定在2020年12月12日進(jìn)行，將每個(gè)單株小心從土壤中拔出，仔細(xì)檢查根部發(fā)病情況，根據(jù)發(fā)病與否進(jìn)行登記掛牌。挑選經(jīng)過田間抗病鑒定的42個(gè)F2群體的771個(gè)單株進(jìn)行KASP分型檢測(cè)。

1.2.2 DNA的提取 取0.1～0.5 g大小的葉片放入96孔板，置于凍干機(jī)中抽真空16 h后于研磨儀中研碎。在96孔板中每孔加入500 μL DNA提取液，振蕩混勻后于75 ℃烘箱中溫浴30 min。溫浴結(jié)束后，4 000 r/min離心10 min，取96孔板中190 μL上清液至新的96孔板，并在新的96孔板中每孔加入190 μL異丙醇。將96孔板于-20 ℃冰箱中放置1 h，然后4 000 r/min離心10 min，棄上清液，置于50 ℃烘箱中烘干，加入500 μL超純水溶解DNA，4 ℃保存用于后續(xù)的KASP檢測(cè)。

1.2.3 KASP分子標(biāo)記設(shè)計(jì) 在數(shù)據(jù)庫(kù)中查找Crr1和LOC103834349序列間的SNP位點(diǎn)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，選擇位于編碼區(qū)內(nèi)第1 486-1 487上非同義突變位點(diǎn)，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Batch Primer3設(shè)計(jì)KASP標(biāo)記引物，包括3條引物：K07-X、K07-Y是2條等位基因特異性正向引物，5′端分別加上熒光序列標(biāo)簽VIC和FAM(下劃線部分為熒光序列標(biāo)簽)，3′末端堿基為SNP位點(diǎn)變異堿基，2條特異性引物末端堿基分別包括SNP位點(diǎn)的等位變異；K07-C為共同的反向引物(圖1)。KASP-PCR反應(yīng)LGC SNP line基因分型平臺(tái)上進(jìn)行，反應(yīng)總體系為0.8 μL，100 μmol/L Primer由濃度為100 μmol/L的K07-X、K07-Y、K07-C與超純水按12∶12∶30∶46的體積比混合得到。PCR反應(yīng)混合物(0.8 μL)包含：100 μmol/L Primer 0.005 9 μL、2×KASP Master Mix 0.394 5 μL、超純水0.399 5μL、DNA(干燥)20～50 ng。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性20 s，56～65 ℃退火延伸60 s，每循環(huán)退火延伸溫度降低0.8 ℃，共計(jì)10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性20 s，57 ℃退火延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)。

KASP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)完成后利用掃描儀Pherastar對(duì)KASP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取，熒光掃描的結(jié)果自動(dòng)轉(zhuǎn)化成圖形。

1.2.4 測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)LOC103834349和Crr1基因序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)OC-1(表1)，該引物對(duì)可以擴(kuò)增

KASP標(biāo)記SNP位點(diǎn)上下游281 bp的基因序列。取田間鑒定抗病和感病的油菜各6株，提取DNA后用上面引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括1.1×T3 PCR Mix 22 μL(北京擎科生物科技有限公司)、10 μmol/L上下游引物各1 μL、478 ng/μL基因組DNA 1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，退火溫度60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min，于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用軟件DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間鑒定

對(duì)種植于大田的F2植株逐一拔出用目測(cè)法檢查根系生長(zhǎng)情況，確定其抗感表型。從42個(gè)F2群體中共鑒定了771個(gè)單株，其中有456株根系正常，沒有染病。有315株根部有腫塊，為染病植株(圖2)。

左側(cè)為抗性材料；右側(cè)為感病材料。The left is the clubroot resistant plants；The right is the clubroot susceptible plants.

2.2 KASP標(biāo)記開發(fā)與驗(yàn)證

利用該等位變異SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的KASP標(biāo)記對(duì)經(jīng)過田間鑒定的771個(gè)單株進(jìn)行分型檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，待檢測(cè)材料清楚地分為兩類(圖3)：聚合在接近X軸的顯示藍(lán)色的樣本的基因型為連接VIC熒光標(biāo)簽序列的純合抗病AA基因型，聚合在接近Y軸上的顯示紅色的樣本的基因型為連接FAM熒光標(biāo)簽序列的純合感病GG基因型，位于坐標(biāo)軸接近45度軸心顯示紫色的樣本基因型表示含有A和G的雜合基因型，左下角顯示黑色的樣本為空白對(duì)照。其中315個(gè)單株含有純合感病基因型GG，322個(gè)單株含有純合抗病基因型AA，134個(gè)單株含有基因型GA。對(duì)編號(hào)為2033的F2群體中125株材料的KASP分型情況(表2)進(jìn)行χ2檢測(cè)，其中純合抗病基因型AA 30株，純合感病基因型GG 33株，雜合基因型GA 62株，經(jīng)χ2檢測(cè)，抗病材料與感病材料符合3∶1理論值，抗病純合基因型、抗病雜合基因型與感病純合基因型的比值符合1∶2∶1理論值，說明該抗病位點(diǎn)為顯性單基因抗病位點(diǎn)。

圖3 KASP標(biāo)記對(duì)771份油菜單株分型Fig.3 KASP marking classification map of 771 Brassica napus

表2 編號(hào)2033 F2群體KASP分型與田間鑒定結(jié)果Tab.2 KASP typing and field identification results of the No.2033 F2 population

表2(續(xù))

AA分型和雜合的GA分型單株田間檢測(cè)均為抗病表型，GG分型均為感病表型，KASP分型結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致。比對(duì)結(jié)果說明，該KASP標(biāo)記對(duì)根腫病抗、感植株進(jìn)行正確分型，可作為新型分子標(biāo)記應(yīng)用于根腫病的分子標(biāo)記輔助選擇。

2.3 測(cè)序驗(yàn)證

取抗、感親本材料各6株，提取DNA后擴(kuò)增KASP標(biāo)記位點(diǎn)上下游281 bp堿基序列。PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示，抗病親本在KASP引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)為AA堿基，感病親本則為GG堿基(圖4)，測(cè)序結(jié)果證明了KASP分型結(jié)果準(zhǔn)確性。

1～6.感病親本；7～12.抗病親本。1-6.Susceptible parents；7-12.Resistant parents.

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記可以避免環(huán)境條件對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)類群分類的影響，對(duì)于一些系譜不清或者混合的材料可以有根據(jù)性的劃分為不同類群。針對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)類群，人們開發(fā)了許多標(biāo)記系統(tǒng)，如RAPD、AFLP、SSR和SNP，以及一些經(jīng)濟(jì)有效的基因分型平臺(tái)來檢測(cè)SNP位點(diǎn)，如Golden Gate[17]和Infinium[18]平臺(tái)，TaqMan和KASP平臺(tái)[19]。KASP分析在用于基因分型的SNP數(shù)量方面提供了靈活性，該方法準(zhǔn)確度高，成本低，這一特征使KASP標(biāo)記比其他SNP基因分型分析更具優(yōu)勢(shì)。本研究針對(duì)與根腫病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)開發(fā)了KASP標(biāo)記，能有效將雜交后代的基因型分類，在檢測(cè)的771個(gè)樣本中，315個(gè)單株為純合感病基因型GG，322個(gè)單株為純合抗病基因型AA，134個(gè)單株為雜合抗病基因型GA，與田間檢測(cè)結(jié)果一致。其中編號(hào)2033的F2群體125株材料中純合抗性基因型AA 30株，純合感病基因型GG 33株，雜合基因型GA 62株。經(jīng)χ2檢測(cè)，抗病材料與感病材料符合3∶1比例，抗病純合基因型、抗病雜合基因型與感病純合基因型的比值符合1∶ 2∶1理論值，說明該抗病位點(diǎn)為顯性單基因抗病位點(diǎn)，與預(yù)期相符。

前人以白菜(B.rapa，AA，2n=20)為根腫病抗性材料，定位了10個(gè)CR基因[15，20-28]，Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc、CRd、CRk、CRs，以及5個(gè)抗病位點(diǎn)，PbBa1.1、PbBa3.1、PbBa3.2、PbBa3.3、PbBa8.1。其中CRa是首個(gè)被人工克隆的根腫病基因[29]；在蘿卜(R.sativus)根腫病抗性相關(guān)的QTL定位檢測(cè)中，檢測(cè)出RsCr1、RsCr2、RsCr3、RsCr4和RsCr55個(gè)抗性基因[30]。華雙5R對(duì)根腫病抗性的產(chǎn)生是由于從蕪菁ECD04中導(dǎo)入了含有PbBa8.1抗性位點(diǎn)的蕪菁基因組片段，該片段含有根腫病抗性基因Crr1。根腫病抗性由2種途徑控制，一種是在抗性中起共同調(diào)控作用的途徑，另一種是起增強(qiáng)抗性的額外途徑。這2種途徑揭示了關(guān)于根腫病抗性進(jìn)化的假說，一是根腫病抗性最初是由單一的主效基因控制，在蕓薹屬植物基因組的進(jìn)化過程中，主效基因分化為2個(gè)功能不同的重復(fù)基因；另一種是抗性基因最初聚集在某一原始基因組區(qū)域，由于外界環(huán)境等其他因素的影響導(dǎo)致染色體重新排列后分布在不同的基因組區(qū)域，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)的某些基因組區(qū)域已經(jīng)觀察到抗病基因的聚類。其中，Crr1和Crr22個(gè)主要QTL區(qū)域在擬南芥第4號(hào)染色體的一個(gè)小區(qū)域內(nèi)存在重疊，該區(qū)域?qū)儆跀M南芥基因組抗病基因簇MRCs之一。這些結(jié)果表明，根腫病抗性基因起源于一個(gè)共同祖先基因組MRC，隨后在進(jìn)化過程中分布到不同區(qū)域。甘藍(lán)型油菜(B.napusL.AACC，2n=38)是由白菜(B.rapa，AA，2n=20)與甘藍(lán)(B.oleracea，CC，2n=18)通過自然雜交和染色體組自然加倍后形成，在進(jìn)化的過程中，蕪菁ECD04保留了根腫病抗性，而甘藍(lán)型油菜散失了根腫病抗性，推測(cè)可能原因之一是在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中甘藍(lán)型油菜基因組中LOC103834349基因丟失了部分序列，從而使其根腫病抗性散失了。

本研究針對(duì)甘藍(lán)型油菜LOC103834349基因和根腫病抗病親本Crr1基因開發(fā)了一個(gè)高通量、低成本的根腫病KASP分子標(biāo)記。田間表型驗(yàn)證表明該標(biāo)記準(zhǔn)確可靠，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量材料進(jìn)行快速可靠的分析鑒定，提高油菜根腫病抗性育種效率，該標(biāo)記可作為一個(gè)新的高通量、高選擇效率的分子標(biāo)記，能快速準(zhǔn)確篩選抗根腫病材料。