李 娟，鄭 姚，王 利

(西南民族大學(xué) 動物科學(xué)國家民委重點實驗室，四川 成都 610041)

水通道蛋白(AQPs)是一類具有高選擇性的跨膜通道蛋白，其主要功能是通過多種途徑實現(xiàn)細胞運輸水和促進一些低分子量的溶質(zhì)通過[1-2]。AQPs由13個成員組成(AQP0～AQP12)[3]，廣泛分布于各種組織和器官中，其中水通道蛋白7(Aquaporins 7，AQP7)是一種水/甘油轉(zhuǎn)運蛋白[4]，允許水和小的中性電荷溶質(zhì)，如甘油、尿素、嘌呤以及亞砷酸鹽通過[5-6]，在機體糖代謝和脂代謝過程中起著重要的作用，影響脂質(zhì)和葡萄糖的穩(wěn)態(tài)。AQP7已成為脂肪細胞代謝的潛在調(diào)節(jié)因子，在脂肪組織中受到胰島素的反向調(diào)節(jié)[7-8]，胰島素通過PI3K途徑影響AQP7基因啟動子區(qū)的胰島素反應(yīng)元件，與成人肥胖有著密切的聯(lián)系[9-10]。除此之外，其還參與了腦缺血、充血性心力衰竭、高血壓和血管生成等相關(guān)疾病的心血管功能和病理過程[11]。牦牛是青藏高原上的關(guān)鍵物種，生長在寒冷低氧等極端環(huán)境，對青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的協(xié)調(diào)和穩(wěn)定發(fā)展起著重要的作用[12-13]，所以牦牛的健康養(yǎng)殖和生產(chǎn)性能的提高極其關(guān)鍵。目前，AQP7基因主要在小鼠[14]、藏山羊[15]和人類[16]中進行研究，在高原牦牛上的研究還未見報道，其作為參與代謝的心血管功能的關(guān)鍵基因，對探討牦牛在高原低氧環(huán)境下的適應(yīng)性和生長有著重大的意義。本研究對九龍牦牛AQP7基因進行克隆及表達分析，探討其在牦牛組織器官中的表達模式，旨在為后續(xù)探討該基因的功能提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與樣品采集

本試驗所用牦牛來自四川九龍縣，隨機選擇3頭健康成年雄性九龍牦牛作為研究對象，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉及瘤胃8個組織，一部分組織裝入凍存管中儲存于液氮，另取一部分用裝有4%多聚甲醛固定液的離心管保存。

1.2 試驗材料

AQP7兔多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus試劑盒、PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit試劑盒和DH5α感受態(tài)細胞均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。AQP7基因擴增及熒光定量引物由上海生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.3 組織總RNA提取及cDNA的制備

稱取0.1 g牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉和瘤胃，將組織剪碎后加入液氮至研缽中進行研磨，按照RNAiso Plus試劑盒說明書對8種組織RNA進行提取，1%瓊脂糖電泳和Nano Drop 2000分光光度計對其進行檢測。獲得質(zhì)量完好的RNA按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書進行cDNA的制備，獲得的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AQP7基因的克隆測序

牦牛心臟cDNA為模板擴增AQP7基因，對應(yīng)的PCR擴增體系為50 μL：上游和下游引物各2 μL(0.5 μmol/L)，1.1×T3 Super PCRMix酶44 μL(1×)，cDNA模板2 μL(100 ng/μL)。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸2 min，4 ℃保存。獲得的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，按照DNA回收試劑盒說明書對目的片段進行膠回收，膠回收產(chǎn)物按照pMDTM19-T Vector Cloning Kit說明書進行連接，轉(zhuǎn)化到DH5α中，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含有氨芐(Amp+)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，PCR進行鑒定，陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.5 AQP7基因生物信息學(xué)分析

測序得到的序列與目的基因序列進行比對，確定其為目的基因后對其基本性質(zhì)進行分析，首先使用ORF Finder尋找序列的開放閱讀框，同時得到相應(yīng)的氨基酸序列。用在線軟件ExPASy、ProtScal、TMHMM、SignalP和SMART對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、結(jié)構(gòu)功能域和蛋白互作進行分析。利用SOPMA軟件對氨基酸二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.6 AQP7基因組織表達差異分析

利用RT-qPCR技術(shù)檢測牦牛AQP7基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉和瘤胃組織中的表達差異，以β-actin作為內(nèi)參矯正基因的相對表達水平。10 μL反應(yīng)體系：上下游引物均為0.8 μL(0.5 μmol/L)，cDNA模板1 μL(50 ng/μL)，TB GreenTMPremixExTaqTMⅡ 5.2 μL(2×)，ddH2O 2.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，59.4 ℃退火10 s，共40個循環(huán)。3個生物學(xué)重復(fù)，每個樣本重復(fù)檢測3次，用2-ΔΔCt法進行分析，用SPSS 26.0軟件分析其顯著性。

1.7 AQP7蛋白免疫組織化學(xué)檢測

用多聚甲醛固定的8種牦牛組織經(jīng)脫水、包埋和切片后，進行染色，3%甲醇雙氧水中室溫放置10 min，用PBS將切片進行清洗，浸入pH值6.0、0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液中，將其進行加熱至沸騰，冷卻后用PBS洗滌2次，隨后向其滴加山羊血清封閉液后室溫放置20 min，滴加一抗(1∶100)，滴加生物素化二抗，將其放置于37 ℃中孵育30 min，用PBS清洗后室溫下進行DAB顯色，最后利用蘇木素進行輕度復(fù)染，脫水透明后用中性樹膠封片。通過顯微鏡觀察染色結(jié)果，采集3張400倍顯微圖像，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果圖片進行分析，用SPSS 26.0軟件分析其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 九龍牦牛AQP7基因克隆

心臟cDNA為模板擴增后獲得與預(yù)期目的片段大小一致的基因片段(圖1)，經(jīng)測序獲得AQP7基因片段長度為993 bp，ORF為993 bp，序列共編碼330個氨基酸，將獲得的序列提交到NCBI，獲得登錄號為MW045313。

圖1 AQP7基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of AQP7

2.2 九龍牦牛AQP7基因生物信息學(xué)分析

獲得的牦牛AQP7基因序列比對后，下載相應(yīng)的同屬及其他動物的序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)與黃牛的同源性最高為99.7%，其次為水牛(98.7%)、山羊(95.0%)和瘤牛(90.6%)，與小鼠的同源性最低，為67.8%。系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)該基因與黃牛和瘤牛聚為一類，親緣關(guān)系最近，與水牛的物種親緣關(guān)系次之(圖2)。九龍牦牛AQP7蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，其分子式為C1651H2548N424O445S16，分子質(zhì)量為35.97 ku，等電點9.32。編碼的氨基酸有17個帶負電殘基(Asp+Glu)，24個帶正電殘基(Arg+Lys)，脂肪系數(shù)為93.94，不穩(wěn)定系數(shù)為33.43，親水性平均值為0.318，推測該蛋白為穩(wěn)定疏水蛋白。功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，牦牛AQP7蛋白有典型的疏水區(qū)，此外有6個典型的跨膜螺旋區(qū)，含有1個MIP結(jié)構(gòu)功能域。蛋白質(zhì)互作分析發(fā)現(xiàn)其與同家族的AQP8、AQP11和AQP12B等存在相互作用。AQP7有α螺旋(27.27%)、β折疊(2.42%)、延伸片段(24.55%)和無規(guī)卷曲(43.33%)4種二級結(jié)構(gòu)，其中無規(guī)卷曲占比最高。

圖2 九龍牦牛AQP7基因進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of AQP7 gene of Jiulong yak

2.3 九龍牦牛AQP7基因組織表達譜

牦牛AQP7基因在不同組織中的表達結(jié)果顯示(圖3)，AQP7基因在心臟的表達量最高，肌肉和腎臟次之，表達量相對較低的組織為肝臟、脾臟、肺臟、小腸和瘤胃。AQP7基因在心臟和肌肉中的表達量極顯著高于腎臟、肝臟和脾臟等其他組織(P<0.01)，且在心臟中的表達量極顯著高于肌肉組織(P<0.01)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。The different capital letters show extremely significant different(P<0.01)；The same letter show no significant different between stages(P>0. 05).

2.4 九龍牦牛組織中AQP7蛋白表達和定位

通過免疫組織化學(xué)方法檢測，發(fā)現(xiàn)AQP7免疫陽性細胞在九龍牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉和瘤胃組織中均檢測到，陽性顆粒主要分布在細胞質(zhì)中。AQP7蛋白表達于多種組織器官，在心臟和肌肉的肌細胞、腎臟的近曲小管內(nèi)皮細胞和集合管內(nèi)皮細胞中表達較為豐富。除此之外，AQP7蛋白在毛細血管內(nèi)皮細胞、肝細胞、淋巴細胞、小腸固有層細胞核中也都有表達(圖4)。平均光密度值分析可知(圖5)，牦牛AQP7蛋白在心臟中的表達量最高，腎臟和肌肉次之，在肝臟、脾臟、肺臟、小腸和瘤胃中的表達量相對較低，且AQP7蛋白在心臟、腎臟和肌肉中的表達顯著高于肝臟、脾臟、肺臟、小腸和瘤胃(P<0.05)。

A1～H1.牦牛AQP7蛋白在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉、瘤胃中的免疫組織染色；A2～H2.陰性對照。MC.肌細胞；KC.枯否細胞；HCs.肝細胞；L.淋巴細胞；PC.上皮細胞；G.腎小球；CT.集合管；PT.近曲小管；IG.腸腺； IP.固有層； SG.顆粒層。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。The different small letters show significant difference(P<0.05);The same letter show no significant difference between stages(P>0. 05).

3 討論

目前，關(guān)于水通道蛋白轉(zhuǎn)運水和其他小分子物質(zhì)的功能研究已相當完善，但對于其通過轉(zhuǎn)運功能參與其他維持機體相對穩(wěn)態(tài)的機制還不清楚。近年來，水通道蛋白在皮膚病[17]、腎臟疾病[18]和癌癥[19]等疾病中的研究越來越多，關(guān)于其低氧適應(yīng)性和生長機制的研究相對較少，牦牛作為高原上耐寒和耐低氧的物種，了解其天然的適應(yīng)性機制有利于解決目前適應(yīng)高原環(huán)境的問題以及提升牦牛生產(chǎn)性能。前人的研究表明，AQP4和AQP9基因與牦牛的低氧適應(yīng)性相關(guān)[20-21]，對AQP7基因的研究有利于加強水通道蛋白家族在低氧適應(yīng)性過程中的作用機制研究，并且參與糖代謝和脂代謝[22-23]，在一定程度上有利于進一步加強探討其低氧適應(yīng)性機制。因此，本研究克隆獲得九龍牦牛編碼區(qū)為993 bp 的AQP7基因，編碼330個氨基酸，與張亞楠等[15]克隆獲得的藏山羊的AQP7基因片段長度一致，同源性也相對較高，其具有的跨膜結(jié)構(gòu)和MIP結(jié)構(gòu)域與藏山羊一致，但蛋白分子式和氨基酸的序列有一定的差異。牦牛和藏山羊均生活在高海拔地區(qū)具有較強的抗逆性，所以在一定程度上有相似性。除此之外，蛋白基本理化性質(zhì)分析和結(jié)構(gòu)也為進一步探討牦牛AQP7蛋白在機體當中可能的功能作用提供參考資料。

前人研究表明，人AQP7基因在腎臟[24]、脂肪組織[25]、睪丸[26]和心臟[27]中均有表達，本研究通過RT-qPCR方法發(fā)現(xiàn)，AQP7基因在九龍牦牛心臟、肝臟和脾臟等8種組織中均有表達，且在心臟、腎臟和肌肉中的表達量最高，與藏山羊的組織表達相對一致[15]。AQPs在心血管系統(tǒng)中舉足輕重，AQPs參與了一些相關(guān)疾病的心血管功能和病理過程[28]，九龍牦牛AQP7在心臟中高表達說明了其在心臟的功能作用中起著重要的作用，這可能是由于牦牛心臟對高原環(huán)境有一定的適應(yīng)性所導(dǎo)致的，可以通過對心臟血液循環(huán)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來促進機體在高原環(huán)境的適應(yīng)性；在腎臟中的高表達可能是由于腎臟作為生物體的泌尿系統(tǒng)，參與了水的過濾和重吸收等過程，水的運輸和其他小分子物質(zhì)的運輸均依賴于水通道蛋白的功能作用；肌肉當中AQP7的高表達，可能是因為肌肉參與了機體的能量代謝過程，且肌肉組織中含有脂肪成分。已有報道表明，人AQP7參與機體的脂代謝過程，調(diào)節(jié)機體的能量穩(wěn)態(tài)[29]。

組織定位研究發(fā)現(xiàn)，AQP7蛋白在九龍牦牛心臟、肝臟和脾臟等8個組織當中均有陽性顆粒，和RT-qPCR結(jié)果基本一致。AQP7定位于小鼠脂肪組織、心臟和橫紋肌的毛細血管[23]，這與本研究結(jié)果相似。AQP7基因敲除小鼠心臟的甘油和ATP含量降低，說明AQP7對闡明心臟生理和病理的過程具有重要意義[28]。此外，AQPs在腎臟特異性細胞類型和液體穩(wěn)態(tài)中的生理和病理功能已被深入研究[30]，并可能成為一種新型的腎臟疾病的理想生物標志物。綜上所述，可以推斷AQP7蛋白在牦牛心臟、腎臟和肌肉中起著至關(guān)重要的作用。牦牛在生理學(xué)和組織學(xué)上都具有獨特的性狀，以適應(yīng)青藏高原低氧高海拔的惡劣生活環(huán)境，具有與黃牛相比更敏感的低氧感知能力和更高的代謝能力[31]。心臟和肌肉均作為能量代謝的重要器官，在對環(huán)境的適應(yīng)性方面起著重要的作用，AQP7通過參與牦牛心臟和肌肉的能量代謝過程來影響牦牛對極端環(huán)境的適應(yīng)性，且AQP7在脂代謝的過程中有著不可替代的作用，本研究結(jié)果對于了解AQP7在牦牛生長過程中對脂代謝的調(diào)控機制提供了重要的參考數(shù)據(jù)，并且為探討牦牛通過AQP7參與能量代謝來影響高原低氧環(huán)境的適應(yīng)性機制奠定了基礎(chǔ)。