霍文韜，周 婷，余 越，楊清瀾，常馨丹，李 鍵，2，熊顯榮，2，熊 燕，2

(1.西南民族大學 畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)被譽為“高原之舟”和“全能家畜”，不僅是牧民賴以生存的生活和生產(chǎn)資料，同時也是自然選擇下具有較強抗逆性的稀有遺傳種質(zhì)資源。我國是世界上牦牛存欄量最多的國家，總數(shù)約1 560萬頭[1]，主要分布在海拔4 000～5 000 m的青藏高原及毗鄰地區(qū)，年均氣溫≤0 ℃，冷季時間漫長，枯草期長達7個月[2]。研究表明，枯草期牦牛掉膘可達30%，經(jīng)解剖分析發(fā)現(xiàn)皮下脂肪組織被大量消耗[3]，表明皮下脂肪組織的沉積及代謝在牦?？购?、耐饑餓的適應過程中發(fā)揮關鍵作用。脂肪組織是動物體重要的儲能器官，動物長期處于饑餓或冷刺激的狀態(tài)，儲存的脂肪被消耗產(chǎn)生能量和熱量，維持機體的基礎代謝及體溫恒定。然而，牦牛脂肪組織沉積及代謝的相關遺傳調(diào)控分子尚未完全明晰。

CIDEA基因是誘導細胞凋亡DNA片段化45樣效應因子(Cell death-inducing DNA fragmentation factor 45(DFFA)-like effectors，CIDE)家族成員之一，其N端與DFFA高度同源[4]。最初的功能研究發(fā)現(xiàn)CIDEA調(diào)節(jié)Caspase依賴的細胞凋亡及DNA的斷裂。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CIDEA在人體和小鼠中與肥胖的發(fā)生、胰島素敏感性及脂滴形成密切相關[4]。敲除CIDEA基因后小鼠的機體能量代謝提高、脂肪水解增加、胰島素的敏感性提高[5-6]。研究表明，CIDEA的亞細胞定位主要位于脂滴，其正向調(diào)節(jié)脂肪細胞內(nèi)脂滴的融合及增大[7-8]。與白色脂肪組織相比，CIDEA在棕色脂肪組織的表達極高[6]，棕色脂肪組織(Brown adiposse tissue，BAT)可消耗脂肪產(chǎn)生熱量，維持機體體溫的穩(wěn)定[9]。牦牛具有極強的抗寒適應性，研究表明，牦牛皮下脂肪組織具有棕色組織的特性[10]，提示CIDEA基因可能參與調(diào)控牦牛脂肪組織的沉積及脂代謝。然而，目前關于牦牛CIDEA基因的序列未知，并且其在牦牛脂肪的時空表達尚不清楚。

因此，本研究以金川牦牛皮下脂肪cDNA為模板，克隆金川牦牛CIDEA基因的CDS區(qū)；通過生物信息學的分析方法，分析CIDEA編碼蛋白的結構和理化性質(zhì)、物種間的同源性及進化關系；采用實時熒光定量PCR技術檢測CIDEA基因在金川牦牛不同組織及皮下脂肪細胞分化過程中的表達模式，旨在為進一步探索CIDEA基因調(diào)控牦?？购m應性提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

試驗所用牦牛共6頭，均為年齡4歲左右的金川牦牛，由四川省阿壩羌族藏族自治州金川縣牦牛養(yǎng)殖場提供。將其屠宰后取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背腰最長肌、腿肌、皮下脂肪等組織置于液氮保存1 d，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃的冰箱長期保存。

1.2 試劑

膠回收試劑盒、pGM-T鏈接試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、PCRMix均購自天根生化科技有限公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、DL2000 DNA Marker均購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司(TaKaRa中國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA提取與cDNA合成 采用TRIzol法提取金川牦牛各組織的總RNA，提取的總RNA用紫外分光光度計測定濃度和質(zhì)量，OD260nm/280nm=1.8～2.0的樣品可用于后續(xù)試驗。將檢測合格的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊，合成cDNA備用。

1.3.2CIDEA基因T載體構建及測序 以金川牦牛脂肪組織RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，對CIDEA基因進行PCR擴增。PCR反應體系：cDNA模板(500 ng/μL)1 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、PCR Mix 7.5 μL、ddH2O 5.5 μL。PCR反應程序：94 ℃ 預變性4 min；94 ℃ 變性45 s，60 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循壞；72 ℃ 延伸6 min。將PCR產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳35 min，照膠觀察是否有目的條帶。將通過PCR 擴增所得到的目的基因，用膠回收試劑盒進行純化。并與PGM-T載體(16 ℃)連接過夜，第2天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，將菌液置于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h，挑取4～6個進行克隆擴大培養(yǎng)。將其他菌液送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序，得到CIDEA基因CDS區(qū)的全長序列。

1.3.3CIDEA基因的生物信息學分析 通過NCBI中的ORF Finder尋找牦牛CIDEA基因的開放閱讀框，并獲取牦牛CIDEA蛋白的氨基酸序列。通過NCBI網(wǎng)站中Blast程序(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將牦牛CIDEA基因的核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列與不同物種進行同源性比對分析，并根據(jù)氨基酸序列利用MEGA 5.0軟件構建物種間進化樹。利用 ProtParam在線程序(https：//web.expasy.org/protparam/)分析牦牛CIDEA蛋白理化性質(zhì)，ProtScale在線程序(https：//web.expasy.org/protscale/)分析CIDEA蛋白親疏水性；同時運用TMHMM在線程序(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)與SignalP在線程序(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白的跨膜區(qū)和信號肽功能；利用GOR4在線程序(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_gor4.html)預測牦牛CIDEA蛋白的二級結構；最后利用 SWISS-MODEL 在線程序(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)預測牦牛CIDEA蛋白的三級結構。牦牛CIDEA基因與不同物種間的同源性比對及蛋白質(zhì)結構預測等具體方法參照文獻 [11-12]。

1.3.4 牦牛前體脂肪細胞的分離與成脂誘導分化 金川牦牛犢牛(<1月齡)屠宰后分離皮下脂肪組織，剪成1 mm3大小，置于15 mL離心管，加入適量的1.5 mg/mL Ⅰ型膠原酶溶液(DMEM配置)在37 ℃水浴鍋消化，每隔15 min振蕩10 s。消化1 h后，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM終止消化，并用100 μm過濾器去除結締組織和未消化的組織。濾液離心5 min (1 700 r/min)，獲得細胞沉淀。用含DMEM、20% FBS、1%青霉素/鏈霉素(P/S)的生長培養(yǎng)基重懸細胞，并接種于10 cm的培養(yǎng)皿中。在37 °C 、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，用PBS洗滌細胞2～3次，然后每2 d更換為新鮮的培養(yǎng)液。待細胞融合率達到80%，傳代至12孔板備用。

待12孔板細胞融合率達到100%，記為第0 天，加入誘導液(Induction medium，IM)孵育3 d，誘導液含DMEM、10% FBS、2.85 μmol/L胰島素、0.3 μmol/L地塞米松(DEXA)、1 μmol/L羅格列酮和0.63 mmol/L 3-甲基-3-異丁基次黃嘌呤，然后用含DMEM、10% FBS、200 nmol/L 胰島素和10 nmol/L T3的分化培養(yǎng)基(Differentiation medium，DM)孵育6 d，形成成熟的脂肪細胞。誘導成脂分化過程中，每3 d更換1次培養(yǎng)基。分別于第0，3，6，9 天棄培養(yǎng)基收集細胞樣本，并保存于-80 ℃冰箱中待提取RNA。

1.3.5 Bodipy染色 分化成熟的脂肪細胞去除DM，用含Bodipy(終濃度為2 μmol/L)和Hoechst 33342(終濃度為10 μg/mL)染料的DM孵育細胞45 min。然后用PBS洗滌細胞3次，加入新鮮DM，用ZEISSLSM 800共聚焦顯微鏡拍攝細胞圖片。

1.3.6 實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR) 針對CIDEA、ADIPOQ和PPARγ基因的CDS序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計特異性定量引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄得到的金川牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、腿肌、背肌等組織及脂肪細胞的cDNA為模板，按照TaKaRa熒光定量試劑盒說明書檢測上述基因的相對表達量，以環(huán)孢素A受體(Peptidylprolyl isomerase A，PPIA)為內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應體系：SYBR Green Master Mix 7.5 μL，cDNA(100 ng/μL)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，RNase-free ddH2O 4.7 μL。qRT-PCR反應條件如下：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃ 延伸30 s，39個循環(huán)。以2-ΔΔCt法分析熒光定量結果。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 根據(jù)上述熒光定量結果，采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)結果進行計算處理。采用SPSS 20.0軟件中單因素方差(One-way ANOVA)模塊分析不同組織中CIDEA基因表達量的差異顯著性；采用SPSS 20.0 軟件中獨立樣本t檢驗模塊分析CIDEA基因在脂肪細胞分化不同時間點的差異顯著性。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 牦牛CIDEA基因的克隆

本試驗以金川牦牛皮下脂肪組織的cDNA為模板，設計特異引物，PCR擴增獲得696 bp的核苷酸序列(圖1-A)，進一步將PCR產(chǎn)物進行切膠回收，構建T載體克隆，送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序，其長度和堿基組成與預測一致(圖1-B)。序列分析發(fā)現(xiàn)，CIDEA基因CDS序列長為684 bp，共編碼227 個氨基酸。因此，本研究克隆獲得了金川牦牛CIDEA基因的CDS序列。

A.金川牦牛CIDEA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳；B.金川牦牛CIDEA基因序列pGM-T載體測序圖譜。A. Agarose gel electrophoresis of CIDEA PCR products in Jinchuan yak；B. The sequencing curve of CIDEA cloned into pGM-T.

2.2 牦牛CIDEA基因在不同物種間的同源性

將金川牦牛CIDEA基因核苷酸及氨基酸序列與GenBank中黃金倉鼠(Mesocricetusauratus)、雞(Gallusgallus)、馬(Equuscaballus)、牛(Bostaurus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、人(Homosapiens)、家養(yǎng)雪貂(Mustelaputoriusfuro)、豬(Susscrofa)等物種進行同源性比對，結果顯示，牦牛CIDEA基因與牛的同源性最高，核苷酸同源性為94.14%，氨基酸同源性為99.54%；與雞的同源性最低，核苷酸同源性僅為63.38%，氨基酸同源性為59.05%(圖2-A、B)。同時根據(jù)氨基酸序列，構建物種進化樹(圖2-C)，與序列比對結果一致，牦牛與普通牛之間的親緣關系最近，與雞之間的親緣關系最遠。

A.核苷酸同源性比對；B.氨基酸同源性比對；C.牦牛與其他物種CIDEA氨基酸序列系統(tǒng)進化樹。A.Nucleotide acid homology comparison；B.Amino acid homology comparison；C.CIDEA amino acid sequence phylogenetic tree of yak and other species.

2.3 CIDEA蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結構預測分析

經(jīng)ProtParam在線程序?qū)﹃笈IDEA蛋白的氨基酸組成與理化性質(zhì)進行預測(表2)，結果顯示，CIDEA蛋白共由20種氨基酸組成，其中亮氨酸(Leu)含量最高，達11.5%；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為16，等電點為8.88，不穩(wěn)定指數(shù)為55.57(>40為不穩(wěn)定)，平均親水指數(shù)-0.292(正數(shù)為疏水，負數(shù)為親水蛋白)，運用ProtScal在線程序進一步驗證該蛋白為不穩(wěn)定的堿性親水蛋白(圖3-A)。利用TMHMM在線程序預測CIDEA蛋白跨膜結構(圖3-B)和SignalP在線程序預測CIDEA蛋白的信號肽(圖3-C)，經(jīng)分析得CIDEA蛋白既不是跨膜蛋白也不是分泌蛋白。此外，由DOR4在線程序?qū)﹃笈IDEA蛋白的二級結構進行預測，結果顯示，二級結構主要為α螺旋(藍色長豎線區(qū))和無規(guī)則卷曲(紫色短豎線區(qū))，分別占比為33.92%，51.98%(圖3-D)；進一步通過SWISS-MODEL在線程序得到CIDEA蛋白的三級結構，其中GMQE值為0.28，模擬質(zhì)量相對較好(圖3-E)。

表2 氨基酸組成Tab.2 Amino acid composition

A.蛋白質(zhì)親疏水性的預測(以0為界正值表示疏水性，負值表示親水性)；B.蛋白跨膜結構預測；C.蛋白信號肽預測(當SPI值接近1時，存在信號肽)；D.CIDEA蛋白三級結構；E.CIDEA蛋白二級結構：紫色豎線表示無規(guī)則卷曲，紅色豎線表示β折疊，藍色豎線表示α螺旋。

2.4 CIDEA基因的組織表達分析

以PPIA基因為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量PCR技術檢測CIDEA基因在金川牦牛不同組織(肺臟、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、脂肪組織、背最長肌、腿肌)中的mRNA表達量。研究結果顯示，CIDEA基因在金川牦牛脂肪組織中表達量最高，在肺臟組織中的表達量最低；在脂肪組織的表達量約為肺臟組織表達量的2 192倍(P<0.01)。在脂肪組織中CIDEA基因的表達量與其他組織相比較，差異均極顯著；此外，CIDEA基因在肝臟的表達量較高，約為肺臟組織表達量的54倍(圖4)。以上研究表明，CIDEA基因在脂肪組織豐富表達。

2.5 CIDEA基因時序表達分析

分離的原代脂肪細胞，待細胞融合率達到100%(圖5-A)，進行成脂誘導分化。在誘導分化過程中，隨誘導分化天數(shù)增加，包含脂滴的脂肪細胞數(shù)量逐漸增加，且隨分化維持時間的延長，脂滴逐漸變大(圖5-B-E)。在分化第9天，用中性脂質(zhì)特異染料Bodipy標記脂滴，Hoechst 33342染料標記細胞核，結果顯示，在誘導細胞內(nèi)有大量脂滴形成，并且少量細胞包含一個大脂滴，細胞核被擠壓到細胞邊緣(圖5-F)。與上述細胞形態(tài)學觀察一致，脂肪細胞分化標志基因表達量如過氧化物酶增殖物激活受體γ基因(PPARγ)、脂聯(lián)素基因(ADIPOQ)在分化過程中呈現(xiàn)上升的趨勢(圖5-G-I)，表明牦牛脂肪細胞分化模型建立成功。同時用上述樣本檢測CIDEA基因在脂肪細胞分化中的表達情況，顯示CIDEA基因在加入IM后，其mRNA顯著上調(diào)，到第6天時其表達量上調(diào)近200倍(圖5-I)，與分化前期相比差異極顯著(P<0.01)；分化第9天時，CIDEA基因與第6天相比略有下降，但差異不顯著(P>0.05)。以上研究結果表明，CIDEA基因在前體脂肪細胞生脂過程中呈上升的表達模式。

L-muscle. 背最長?。徊煌懽帜副硎静町愶@著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖5同。

A. 原代脂肪細胞；B-E. 成脂誘導后第3，6，9天細胞形態(tài)；F. 分化第9天Bodipy染色：細胞核藍色熒光標記，脂滴綠色熒光標記；G-I. 脂肪細胞分化過程中PPARγ(G)、ADIPOQ(H)、CIDEA(I)的相對mRNA表達量。

3 討論與結論

牦牛分布于我國青藏高原及其毗鄰地區(qū)，其冷季適應性研究是探索其高原適應性的重點領域之一。脂肪組織作為機體儲能的主要形式[13]，脂肪細胞及其分泌產(chǎn)物涉及廣泛生理過程[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在飼草豐富的暖季，牦牛皮下脂肪沉積較多；而在冷季枯草期，皮下脂肪組織被大量消耗，表明牦牛皮下脂肪組織的分解代謝是其維持枯草期最基本生命活動的重要能量來源[15]。盡管目前的研究發(fā)現(xiàn)了牦牛皮下脂肪組織的沉積與消耗對其冷季適應性極為重要，但關于牦牛皮下脂肪組織脂代謝分子遺傳學基礎及其調(diào)控因子仍不清楚。

本研究采用PCR法擴增得到金川牦牛CIDEA基因完整編碼區(qū)序列，其中CDS序列長度為684 bp，編碼227個氨基酸，是一個堿性親水蛋白。物種間同源性比對及進化樹結果表明，金川牦牛CIDEA基因與普通牛的同源性最高、親緣關系最近，與雞的同源性低、親緣關系最遠，表明CIDEA基因在反芻動物和家禽中的功能可能存在差異。

通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，金川牦牛CIDEA基因在脂肪組織中表達量最高，肝臟、背腰最長肌也有較高表達量，肺臟中表達量最低。與本研究結果一致，CIDEA基因在小鼠心臟、肝臟、脾臟、小腸、淋巴結、脂肪、腦、腎臟等組織中均有表達，其中在脂肪組織中表達最高[16-17]。在豬中，CIDEA基因在豬脂肪組織中表達量最高，在小腸、肌肉和心臟中表達較低[18]。在肉雞各組織中檢測結果顯示，CIDEA基因也在脂肪組織中的表達量最高，其次是腎臟、肝臟和卵巢，在心臟、脾臟、肺臟、胸肌、腿肌中表達量較少[19]。在隆林山羊中，CIDEA基因在脂肪組織的表達量極顯著高于其他組織與器官[20]。綜上，本研究結果及其他動物中的表達分析顯示，CIDEA基因在脂肪組織的表達量最高，在其他組織中的表達量有所差異。因此，推測CIDEA是脂肪組織特異表達基因。

目前的研究僅報道了CIDEA基因在小鼠體內(nèi)具有調(diào)控脂肪沉積及脂代謝的功能。采用aP2啟動子構建CIDEA的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠皮下脂肪沉積增加，產(chǎn)生肥胖的表型，但是內(nèi)臟脂肪組織大小不變，且提高了胰島素的敏感性[6]，表明CIDEA基因在不同類型脂肪組織的功能及作用機制具有差異性。白色脂肪組織和棕色脂肪組織在動物機體能量代謝中的作用差異較大，有研究比較小鼠白色和棕色脂肪組織CIDEA基因的表達，結果顯示，其在棕色脂肪組織中有較高的表達量[4，21]。CIDEA基因敲除小鼠棕色脂肪組織肪代謝速率顯著提高，脂肪酸氧化速率明顯加快，其可能的分子機制為CIDEA與AMPK-β亞基特異性作用形成蛋白復合體，促進AMPK復合體通過泛素化介導蛋白酶體途徑的降解[22]。盡管謝鳳蓮[9]研究報道牦牛的皮下脂肪組織具有棕色脂肪組織的特性，高表達產(chǎn)熱相關的標志基因，如解偶聯(lián)蛋白1(Uncoupling protein 1，UCP1)等，但CIDEA基因在牦牛皮下脂肪沉積的功能及作用機制仍需要進一步研究。

鑒于在牦牛體內(nèi)研究CIDEA基因的功能存在較大的困難，因此，本研究成功構建了金川牦牛前體脂肪細胞成脂分化的體外模型。采用酶消化法分離的原代前體脂肪細胞，經(jīng)IM和DM的誘導能分化形成成熟的脂肪細胞，ADIPOQ和PPARγ成脂標志基因均在分化過程中呈現(xiàn)上升的趨勢。以此為模型，發(fā)現(xiàn)CIDEA基因隨著分化天數(shù)的增加，表達水平逐漸升高，并且分化末期與前體脂肪細胞相比，差異極顯著(P<0.01)；分化第9天時，CIDEA基因與第6天相比略有下降，但差異不顯著(P>0.05)。因此，CIDEA基因在脂肪組織特異表達以及分化末期高表達的結果提示其參與牦牛的脂肪沉積與脂肪細胞分化，這些數(shù)據(jù)為進一步解析牦牛CIDEA基因在脂肪代謝中的功能奠定了重要基礎。

本研究成功克隆了金川牦牛CIDEA基因完整編碼區(qū)序列，序列全長696 bp，其中CDS序列長度為684 bp，共編碼227個氨基酸。生物信息學分析預測金川牦牛CIDEA蛋白是一個保守的堿性親水蛋白，無信號肽與跨膜結構域，二級結構主要為α螺旋與無規(guī)則卷曲。組織表達分析結果顯示，CIDEA基因在脂肪組織的表達量最高，且在脂肪細胞分化過程中呈現(xiàn)上升的趨勢。由此可推測，CIDEA基因與牦牛脂肪細胞分化與脂肪沉積密切相關。