代惠潔，程 琳，曹 慧，竺曉平，趙 靜

(1.濰坊科技學(xué)院，山東省高校設(shè)施園藝重點實驗室，山東 壽光 262700；2.濰坊學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東省生物化學(xué)與分子生物學(xué)高校重點實驗室，山東 濰坊 261061；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點實驗室，山東 泰安 271018；4.山東壽光蔬菜種業(yè)集團(tuán)有限公司，山東省設(shè)施蔬菜分子育種省級重點實驗室，山東 壽光 262700)

煙粉虱(BemisiatabaciGennadius)作為我國重要的農(nóng)業(yè)入侵害蟲，寄主范圍廣泛，遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前研究發(fā)現(xiàn)煙粉虱至少是由44個隱種組成的復(fù)合群[1]。由于煙粉虱MED隱種(Q煙粉虱)比MEAM1隱種(B煙粉虱)具有更強(qiáng)的抗藥性和寄主適應(yīng)性[2-4]，在我國很多地區(qū)MED隱種已成為危害當(dāng)?shù)刈魑锏膬?yōu)勢隱種。煙粉虱作為一種重要的媒介昆蟲，其傳播植物病毒造成的危害比自身危害更為嚴(yán)重。Fiallo-Olivé 等[5]報道由煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)現(xiàn)已擴(kuò)散至全球35個國家和地區(qū)。我國于2012年在北京保護(hù)地栽培番茄上首次報道了ToCV的發(fā)生[6]，該病毒在我國迅速傳播蔓延，目前已在主要番茄種植區(qū)普遍暴發(fā)、流行，防控形勢嚴(yán)峻[7-10]。

ToCV不能通過汁液摩擦傳播，只能依靠媒介昆蟲以半持久方式傳播[11-12]。Shi 等[13]研究表明，煙粉虱MED隱種對ToCV的獲毒、持毒和傳毒能力明顯高于MEAM1隱種。植物病毒作為一種異源物質(zhì)，媒介昆蟲取食獲毒后可能會通過調(diào)節(jié)自身的防御反應(yīng)或調(diào)節(jié)反應(yīng)改變對帶毒植株的適應(yīng)度，而昆蟲體內(nèi)的解毒酶和保護(hù)酶在這一生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14-17]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，煙粉虱取食番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)侵染的番茄72 h和30 d后，體內(nèi)羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)活性先升高后降低；細(xì)胞色素P450酶(Cytochrome P450，P450)和過氧化物酶(Peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性則持續(xù)升高[14]。褐飛虱(NilaparvatalugensStal)、白背飛虱(SogatellafurciferaHorváth)取食南方黑條水稻矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)侵染的水稻后，成蟲和若蟲體內(nèi)保護(hù)酶SOD、POD、CAT活性均隨取食時間的延長而增加[18]。而麥二叉蚜(SchizaphisgraminumRondani)取食大麥黃矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus，BYDV)侵染的小麥后，體內(nèi)保護(hù)酶POD、SOD、CAT活性和解毒酶堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)活性卻顯著降低[15]。從適應(yīng)度角度來看，Li 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，煙粉虱MED隱種取食ToCV侵染的番茄植株，繁殖力顯著降低，產(chǎn)卵期和雌成蟲壽命顯著縮短，這可能是由于解毒酶基因表達(dá)水平升高需要消耗更多能量，因此導(dǎo)致其在發(fā)病番茄植株上的適合度下降。Luan等[20]研究B煙粉虱取食中國番茄黃化曲葉病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus，TYLCCNV)侵染的煙草，也發(fā)現(xiàn)煙粉虱通過降低解毒酶活性來降低能量消耗，從而提高其在帶毒煙草上的適合度。媒介昆蟲獲毒后其體內(nèi)解毒酶和保護(hù)酶活性的不同變化可能因媒介昆蟲、病毒以及寄主植物種類的不同而異。除基因表達(dá)水平會發(fā)生變化外，差異基因參與的代謝通路、生物學(xué)功能也是需要重點關(guān)注的部分。Kaur 等[21]對煙粉虱MEAM1隱種取食ToCV侵染番茄的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，其代謝通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、運輸和分解代謝、受體等代謝通路發(fā)生變化。

目前，國內(nèi)外關(guān)于煙粉虱對ToCV傳播特性、傳毒機(jī)制以及適應(yīng)度等方面的研究已有廣泛報道[22-28]，但從基因水平揭示煙粉虱取食ToCV侵染番茄引起生理防御從而改變適應(yīng)度的研究還鮮有報道。為明確取食ToCV侵染寄主番茄對煙粉虱防御反應(yīng)的影響，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序和實時熒光定量PCR研究煙粉虱MED隱種取食ToCV侵染番茄和健康番茄6，12，24，48 h，體內(nèi)解毒酶P450、GST、CarE和保護(hù)酶SOD、POD、CAT基因表達(dá)和代謝功能的變化，以期進(jìn)一步闡明煙粉虱取食ToCV獲毒后的防御機(jī)制，豐富煙粉虱-植物病毒-寄主植物間的互作理論，為田間ToCV有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx與植物

供試?yán)ハx：無毒煙粉虱MED隱種在養(yǎng)蟲室內(nèi)以棉花(冀棉-616)為寄主繼代飼養(yǎng)，并定期檢測煙粉虱種群純度。飼養(yǎng)條件：溫度(T)=(26± 1)℃，相對濕度(RH)= 60%～80%，光周期(L∶D)=16 h∶8 h。

供試植物：試驗所用番茄品種為齊達(dá)利(瑞士先正達(dá)公司)，為市場主栽品種，抗(耐)番茄黃化曲葉病毒。將番茄種子播在裝有育苗基質(zhì)的75穴育苗盤中，置于25～27 ℃的智能溫室內(nèi)用防蟲網(wǎng)(孔徑=0.15 mm)隔離培養(yǎng)，待植株長至3葉期定植于花盆中(Φ = 12 cm)備用。

ToCV感病番茄植株：用微蟲籠將帶毒MED隱種成蟲接在3葉期健康番茄植株上取食48 h移去成蟲，并將葉片上煙粉虱的卵清除干凈。將番茄植株置于25～27 ℃智能溫室內(nèi)用防蟲網(wǎng)(孔徑=0.15 mm)隔離培養(yǎng)，30 d后選擇具有明顯發(fā)病癥狀并經(jīng)RT-PCR檢測被ToCV侵染的植株備用。

1.2 轉(zhuǎn)錄組樣品的制備

將健康初羽化的煙粉虱雌成蟲用微蟲籠夾在感病番茄植株和健康番茄植株葉片背面，分別取食6，12，24，48 h后，收集至EP管內(nèi)，用液氮速凍，置于-80 ℃保存。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)，共24個樣本，每個樣本供試煙粉虱300頭。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序及分析

采集的煙粉虱樣品利用Invitrogen公司的TRIzol RNA Extraction Kit提取其總RNA，純化后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop等技術(shù)檢測所得RNA的完整度、純度和濃度，將合格樣品委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成基因組測序。原始序列數(shù)據(jù)經(jīng)過濾軟件去除不合格的reads后獲得高質(zhì)量的clean reads，再根據(jù)HISAT軟件進(jìn)行基因組序列比對分析(參考基因組：ftp：//whiteflvenomics.org/pub/MEAM1/)獲得readcount數(shù)據(jù)。采用HTSeq軟件對各樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平分析，使用的模型為union?；虿町惐磉_(dá)分析的輸入數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平分析中得到的read count數(shù)據(jù)，通過DESeq或TMM標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行差異分析。按照p-adjusted(q-value)<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因[29]。

1.4 實時熒光定量PCR驗證

從煙粉虱取食24 h樣品測序結(jié)果中分別選取3種解毒酶和3種保護(hù)酶基因(Bta02803、Bta12080、Bta04439、Bta11281、Bta13466、Bta01915)，進(jìn)行qRT-PCR驗證，以β-actin作為內(nèi)參基因。利用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計6條基因的檢測引物，本研究所用到的所有引物序列信息見表1。采用Invitrogen公司的TRIzol RNA Extraction Kit提取煙粉虱樣品總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)說明書合成第一鏈cDNA用于PCR反應(yīng)。熒光定量反應(yīng)按照以下步驟進(jìn)行：cDNA 1 μL，上游引物(10 μmol/L)和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×ULtra SYBR Mixture 12.5 μL，RNase-Free Water 補(bǔ)充到25 μL。反應(yīng)液在95 ℃預(yù)變性10 min，再按照95 ℃變性15 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s循環(huán)40次，收集熒光信號。每個樣品包括3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)。

表1 所用引物序列信息Tab.1 The specific primers used

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)公式2-ΔΔCt計算煙粉虱體內(nèi)解毒酶和保護(hù)酶基因的相對表達(dá)量，默認(rèn)對照組基因相對表達(dá)量為1。酶基因相對表達(dá)量采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，并利用軟件SPSS 23.0 Tukey's進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq相關(guān)性分析

本研究中所有時間點的3個生物學(xué)試驗操作是可重復(fù)的且變異不大，為確保后續(xù)的差異基因分析結(jié)果更為可靠，利用樣本間基因表達(dá)水平相關(guān)性來進(jìn)行檢驗和評估。相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品之間表達(dá)模式相似度越高。由圖1可以看出，每個時間點的3個生物學(xué)重復(fù)樣本之間相關(guān)性系數(shù)均在0.967以上，且絕大多數(shù)高于0.99，說明同組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)一致性較好。由于試驗大背景以及設(shè)計所限，各組時間點之間間隔較近，試驗組和對照組所有樣本之間相關(guān)系數(shù)都不低，說明煙粉虱取食帶毒番茄和健康番茄的48 h內(nèi)轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)模式大致是相同的。

圖1 各樣本間相關(guān)系數(shù)圖Fig.1 Correlation index among samples

2.2 煙粉虱MED隱種取食ToCV侵染番茄對其體內(nèi)解毒酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

煙粉虱MED隱種取食感染ToCV侵染番茄，高通量測序共檢測出其體內(nèi)33個P450基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，其中表達(dá)量上調(diào)基因23個、下調(diào)基因11個。在P450所有上調(diào)基因中，煙粉虱取食獲毒6 h檢測出9個基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，12 h檢測出8個，24 h檢測出17個，48 h檢測出6個(圖2)。在P450所有下調(diào)基因中，煙粉虱取食獲毒6 h未檢測出轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化的基因，12 h檢測出1個，24 h檢測出8個，48 h檢測出5個(圖2)。此外，一些基因在煙粉虱取食獲毒不同時間點發(fā)生持續(xù)性表達(dá)差異，如Bta02803基因在6，24，48 h均發(fā)生上調(diào)，Bat02034基因在24，48 h發(fā)生上調(diào)(表2)；Bta10847基因在12，48 h發(fā)生下調(diào)，Bta11611基因在24，48 h發(fā)生下調(diào)(表3)；但是并未發(fā)現(xiàn)在4個時間點均發(fā)生過表達(dá)或低表達(dá)的P450基因。差異表達(dá)程度最大的P450基因為Bta04697，出現(xiàn)在煙粉虱取食獲毒后24 h，差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到4.65。

煙粉虱MED隱種取食感染ToCV侵染番茄，高通量測序共檢測出其體內(nèi)11個GST基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，其中表達(dá)量上調(diào)基因6個、下調(diào)基因5個。煙粉虱取食獲毒6 h有4個GST基因出現(xiàn)上調(diào)，1個GST基因出現(xiàn)下調(diào)；12 h有1個GST基因發(fā)生上調(diào)，2個GST基因發(fā)生下調(diào)；24 h共有6個GST基因出現(xiàn)上調(diào)，2個GST基因出現(xiàn)下調(diào)；48 h上調(diào)、下調(diào)GST基因各檢測出2個(圖2)。在所有GST上調(diào)基因中，Bta09332、Bta12080、Bta12671、Bta14179在不同時間點均被檢測出；在GST下調(diào)基因中，Bta15447在6，24，48 h均發(fā)生低表達(dá)(表2-3)。Bta12671基因在煙粉虱取食獲毒6 h發(fā)生上調(diào)，12 h發(fā)生下調(diào)，在24，48 h又恢復(fù)過表達(dá)。差異表達(dá)程度最大的GST基因為Bta12671，出現(xiàn)在煙粉虱取食獲毒后48 h，差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到1.74。

煙粉虱MED隱種取食感染ToCV侵染番茄，高通量測序共檢測出其體內(nèi)6個CarE基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化(圖2)。煙粉虱取食獲毒6 h有2個CarE基因Bta04439、Bta06821發(fā)生上調(diào)，無下調(diào)基因；12 h有2個CarE基因Bta03563、Bta08899發(fā)生上調(diào)，無下調(diào)基因；24 h有3個CarE基因Bta04439、Bta04538、Bta06821出現(xiàn)上調(diào)，1個CarE基因Bta08027出現(xiàn)下調(diào)；而48 h未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化的CarE基因(表2-3)。在發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平變化的CarE基因中，Bta04439和Bta06821在6，24 h同時出現(xiàn)上調(diào)，差異表達(dá)程度最大的CarE基因為Bta04439，出現(xiàn)在煙粉虱取食獲毒后24 h，差異表達(dá)倍數(shù)為0.99。

圖2 煙粉虱MED隱種取食ToCV侵染番茄不同時間解毒酶基因上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)量Fig.2 Numbers of up-regulated and down-regulated genes of detoxification enzyme genes in B. tabaci MED feeding on ToCV-infected tomato at different times

注釋Annotation時間/hTime基因編號Gene IDReadcount-ToCVReadcount-HLog2FCAdjusted p細(xì)胞色素P450酶6Bta02803819.90393.661.061.09E-05Cytochrome P450Bta0311174.4012.432.587.92E-09Bta04696150.3035.212.092.21E-11Bta0555389.1545.110.980.02Bta05554981.80623.700.650.01Bta07679983.83487.121.010.00Bta08018696.67334.831.061.06E-08Bta12079791.78349.701.184.03E-11Bta149053 643.522 577.950.500.0212Bta04552291.39113.091.370.01Bta055541 344.14831.190.690.01Bta0722169 847.7658 965.040.240.00Bta07692242.40120.251.012.52E-06Bta08018646.06391.450.729.49E-05Bta119221 033.17671.020.623.88E-06Bta149053 068.842 472.350.310.005Bta15119926.27492.960.910.0524Bta02034796.28542.070.550.03Bta02803679.11355.400.931.28E-07Bta0311168.918.443.030.02Bta04696181.2661.371.560.00Bta0469754.452.184.650.01Bta05553127.1273.090.800.00Bta0604397.4552.880.880.02Bta06378908.10680.330.420.04Bta0638114.594.751.620.05

表2(續(xù))

2.3 煙粉虱取食ToCV侵染番茄對其體內(nèi)保護(hù)酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

煙粉虱MED隱種取食ToCV侵染番茄，高通量測序共檢測出2個SOD基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化(圖3)，其中Bta11281基因在6，24，48 h均發(fā)生過表達(dá)(表4)。煙粉虱取食獲毒24 h檢測到另一個SOD基因表達(dá)顯著下調(diào)(表5)。Bta11281在煙粉虱取食獲毒6 h時差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)1.72，差異程度最大。此外，分析還發(fā)現(xiàn)5個POD基因表達(dá)水平發(fā)生變化，其中表達(dá)量上調(diào)基因4個、表達(dá)量下調(diào)基因1個。差異表達(dá)程度最大的POD基因為Bta13466，出現(xiàn)在煙粉虱取食獲毒6 h，差異表達(dá)倍數(shù)為2.48。盡管高通量測序有檢測到CAT基因的存在，但該基因在煙粉虱取食獲毒6，12，24，48 h均未發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的差異變化。從數(shù)量上看，差異表達(dá)保護(hù)酶基因的數(shù)量遠(yuǎn)小于解毒酶基因數(shù)量，說明解毒酶的活躍度更高。

表3 煙粉虱MED隱種取食ToCV侵染番茄不同時間解毒酶基因的下調(diào)情況Tab.3 Down-regulated detoxification enzyme genes in B. tabaci MED feeding on ToCV-infected tomato at different times

圖3 煙粉虱MED隱種取食ToCV侵染番茄不同時間保護(hù)酶基因上調(diào)、下調(diào)基因數(shù)量Fig.3 Numbers of up-regulated and down-regulated genes of protective enzyme genes in B. tabaci MED feeding on ToCV-infected tomato at different times

2.4 煙粉虱取食ToCV侵染番茄體內(nèi)解毒酶和保護(hù)酶基因的熒光定量PCR驗證分析

選3個解毒酶基因和3個保護(hù)酶基因進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證分析(圖4)。結(jié)果表明，煙粉虱取食獲毒6，24，48 h，解毒酶P450基因相對表達(dá)量分別是對照組的1.25，2.46，5.61倍，均顯著高于對照組(P<0.05)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致；12 h相對表達(dá)量是對照組的0.88倍，二者間無顯著差異(P>0.05)，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。GST基因相對表達(dá)量在煙粉虱取食獲毒6，12，24，48 h均顯著高于對照組(P<0.05)，分別是對照組的1.90，1.70，1.93，2.22倍，也與轉(zhuǎn)錄組差異分析結(jié)果相同；與GST基因相反，CarE基因在煙粉虱取食獲毒4個時間點其表達(dá)量與對照組均無顯著差異(P>0.05)，但在轉(zhuǎn)錄組分析中，該基因(Bta04439)分別在6，24 h發(fā)生過表達(dá)(表2)。

表4 煙粉虱MED隱種取食ToCV侵染番茄不同時間保護(hù)酶基因上調(diào)情況Tab.4 Up-regulated protective enzyme genes in B. tabaci MED feeding on ToCV-infected tomato at different time points

表5 煙粉虱MED隱種取食ToCV侵染番茄不同時間保護(hù)酶基因下調(diào)情況Tab.5 Down-regulated protective enzyme genes in B. tabaci MED feeding on ToCV-infected tomato at different times

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同小寫字母表示利用Tukey′s 方差檢驗在P<0.05水平差異顯著。Datas are mean ± s，different letters indicate significant difference at P<0.05 level by Tukey′s test.

煙粉虱取食獲毒6，12，24，48 h，保護(hù)酶SOD基因相對表達(dá)量分別是對照組的2.00，1.22，2.14，2.30倍，均顯著高于對照組(P<0.05)；該基因在轉(zhuǎn)錄組分析中12 h并未出現(xiàn)差異表達(dá)(表4)，其余3個時間點均過表達(dá)，因此，熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果略有不同。POD基因相對表達(dá)量在煙粉虱取食獲毒6，24，48 h分別是對照組的1.58，1.32，1.62倍，均顯著高于對照組(P<0.05)；12 h相對表達(dá)量是對照組的1.02倍，二者無顯著差異(P>0.05)；轉(zhuǎn)錄組分析中，該基因僅在6，24 h出現(xiàn)過表達(dá)，而12，48 h均未發(fā)現(xiàn)與對照組有顯著差異(P>0.05)(表4)，2種方法對于48 h的差異表達(dá)水平分析存在不同。除此之外，CAT基因相對表達(dá)量在煙粉虱取食獲毒6，12，48 h分別是對照組的1.01，1.01，0.98倍，與對照組均無顯著差異(P>0.05)，24 h相對表達(dá)量是對照組的0.85倍，轉(zhuǎn)錄水平被顯著抑制(P<0.05)。該CAT基因在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中任意時間點均未出現(xiàn)表達(dá)水平的顯著差異，而qPCR顯示該基因在24 h表達(dá)量被顯著抑制，與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果有所不同，其他3個時間點分析結(jié)果一致。

2.5 差異表達(dá)基因功能分析

對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，共注釋到生物過程、細(xì)胞組分及分子功能三部分。煙粉虱獲毒后6 h，差異表達(dá)基因主要富集到單一有機(jī)物過程、膜固有組件和轉(zhuǎn)運活性；獲毒后12 h，差異表達(dá)基因主要富集到有機(jī)氮化合物代謝、核糖體和分子功能上；獲毒后24 h，細(xì)胞進(jìn)程、細(xì)胞組分以及結(jié)構(gòu)分子活性對應(yīng)的差異表達(dá)基因最多；獲毒后48 h，大部分差異表達(dá)基因注釋到細(xì)胞進(jìn)程、膜部分和底物特異性跨膜。由于煙粉虱獲毒后12，24 h是基因轉(zhuǎn)錄活躍度的兩個極端，因此，重點分析了這2個時間點下差異表達(dá)基因的GO功能特征。從生物過程來看，煙粉虱獲毒后12 h主要富集到氧化還原過程和唾液腺細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡過程(圖5)，而獲毒后24 h差異表達(dá)基因參與胞內(nèi)細(xì)胞器、核糖體、核糖和蛋白復(fù)合物等過程(圖6)。在細(xì)胞組分方面，獲毒后12 h只有少量差異表達(dá)基因被注釋到fusome，而獲毒后24 h差異表達(dá)基因富集的代謝通路很多，如胞內(nèi)細(xì)胞器、核糖體、核糖和蛋白復(fù)合物、細(xì)胞組分、高分子復(fù)合物等。在分子功能層面，煙粉虱獲毒后12 h差異表達(dá)基因主要富集到催化活性、氧化還原酶活性和角質(zhì)層結(jié)構(gòu)組成等(圖5)；獲毒后24 h差異表達(dá)基因主要參與核糖體結(jié)構(gòu)組成、結(jié)構(gòu)分子活性(圖6)?？梢钥闯?，雖然取食時間上只相差12 h，但2個時間點下煙粉虱體內(nèi)基因參與的生物學(xué)功能完全不同，獲毒后12 h煙粉虱體內(nèi)涉及角質(zhì)層結(jié)構(gòu)組成和唾液腺細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡過程基因顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步了解煙粉虱獲毒后基因表達(dá)的生物學(xué)功能變化，本研究還進(jìn)行了KEGG功能注釋。與對照組相比，煙粉虱取食帶毒番茄后差異表達(dá)基因主要參與代謝通路、淀粉和蔗糖代謝、碳代謝、核糖體等路徑。其中，煙粉虱獲毒后6 h，淀粉和蔗糖代謝(adjustedP=0.02)、半乳糖代謝(adjustedP=0.017)存在顯著性差異(adjustedP=1.16E-08)；獲毒后12 h，溶酶體(adjustedP=1.79E-11)、淀粉和蔗糖代謝(adjustedP=1.16E-08)、半乳糖代謝(adjustedP=2.93E-08)途徑出現(xiàn)顯著性差異。除此之外，其他時間點下代謝通路均未達(dá)到顯著性差異(adjustedP>0.05)。參與溶酶體途徑的差異基因主要編碼組織蛋白酶和硫酸酯酶，在生物體中起分解代謝作用。遺憾的是，大部分解毒酶和保護(hù)酶差異基因在GO注釋和KEGG代謝通路分析上沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異(adjustedP>0.05)。

GO類別分三大類: 生物過程包括1. 氧化還原過程；2. 唾液腺細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡；3. 自噬性細(xì)胞死亡；4. 幾丁質(zhì)代謝過程；5. 含葡萄糖胺化合物代謝過程；6. 剛毛發(fā)育；7. 核糖體合成；8. 氨基糖代謝過程；9. 有機(jī)氮化合物生物合成過程；10. 乙醛酸代謝過程；11. 有機(jī)氮化合物代謝過程；細(xì)胞組分包括12. 融合體；13. 核糖體；分子功能包括14. 作用于糖基鍵的水解酶活性；15. 結(jié)構(gòu)分子活性；16. 催化活性；17. 水解酶活性；18. 角質(zhì)層結(jié)構(gòu)組成；19. 氧化還原酶活性；20. 鐵離子結(jié)合；21. 核糖體結(jié)構(gòu)組成；22. 單氧酶活性；23. 輔酶結(jié)合；24. 幾丁質(zhì)結(jié)合；25. NAD結(jié)合；26. 羥甲基、甲酰基及相關(guān)轉(zhuǎn)移酶活性；27. 分子功能；28. 輔因子結(jié)合；29. 作用于供體的CH-OH基團(tuán)的氧化還原酶活性；30. 作用于線性酰胺中的碳氮(而非肽鍵)的水解酶活性。

GO類別分三大類: 生物過程包括1. 核糖體生物合成；2. 核糖體蛋白復(fù)合物合成；3. 肽代謝過程；4. 細(xì)胞酰胺代謝過程；5. 肽生物合成過程；6. 有機(jī)氮化合物生物合成過程；7. 轉(zhuǎn)化；8. 酰胺生物合成過程；9. 有機(jī)含氮化合物代謝過程；10. 細(xì)胞氮化合物代謝過程；11. 前體代謝產(chǎn)物和能量發(fā)生；12. 細(xì)胞過程；13. 細(xì)胞呼吸；14. 細(xì)胞組分合成；15. 基因表達(dá)；細(xì)胞組分包括16. 核糖體；17. 核糖和蛋白復(fù)合物；18. 高分子復(fù)合物；19. 胞內(nèi)非膜結(jié)合細(xì)胞器；20. 非膜結(jié)合細(xì)胞器；21. 細(xì)胞組分；22. 細(xì)胞；23. 細(xì)胞組分；24. 核糖體亞基；25. 細(xì)胞內(nèi)部分；26. 胞內(nèi)細(xì)胞器；27. 細(xì)胞內(nèi)部分；28. 細(xì)胞器；分子功能包括29. 核糖體結(jié)構(gòu)組成；30. 結(jié)構(gòu)分子活性。

3 討論與結(jié)論

媒介昆蟲-植物病毒-寄主植物在長期進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的互作關(guān)系，媒介昆蟲取食被植物病毒感染的寄主植物會通過調(diào)整自身的防御反應(yīng)以適應(yīng)病毒的侵入。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)煙粉虱MED隱種取食感染ToCV番茄后，其體內(nèi)解毒酶基因被不同程度誘導(dǎo)過表達(dá)或抑制表達(dá)，但總體上過表達(dá)基因占主導(dǎo)地位。3種解毒酶基因中，編碼P450和GST的基因數(shù)及表達(dá)差異程度高于CarE，表明煙粉虱在與ToCV、寄主植物互作過程中P450和GST基因可能更活躍。此外，從煙粉虱獲毒不同時間點看，24 h參與的解毒酶基因數(shù)最多且差異表達(dá)程度較高，說明煙粉虱在取食ToCV 24 h具有較強(qiáng)的解毒代謝能力。P450基因家族的差異基因數(shù)量先升高后降低，可能是由于病毒等外源物質(zhì)誘導(dǎo)了媒介昆蟲體內(nèi)P450的活性，隨著病毒量增加，昆蟲又通過降低解毒酶活性來減少能量的消耗[14]。另外2種解毒酶GST和CarE平均表達(dá)量先降低后升高，說明昆蟲體內(nèi)3種主要解毒酶基因可能在不同時間發(fā)揮不同的協(xié)同作用。除解毒酶外，昆蟲體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)在受到外界刺激或外源物質(zhì)誘導(dǎo)時也會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。劉爍安等[30]研究表明，螺旋粉虱(AleurodicusdispersusRussell)感染蠟蚧輪枝菌(Verticillumlecanii(Zimm.)Gam & Zare)后其體內(nèi)SOD活力顯著高于對照組。而Kaur等[21]研究發(fā)現(xiàn)，B煙粉虱取食ToCV 獲毒24 h，體內(nèi)SOD基因表達(dá)量顯著上調(diào)。本研究中，煙粉虱MED隱種取食感染ToCV番茄后，體內(nèi)SOD、POD、CAT基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生不同程度的變化，從基因參與數(shù)量上來說遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于解毒酶基因，這可能與基因?qū)ν庠次镔|(zhì)的敏感性不同有關(guān)。與取食健康番茄相比，煙粉虱取食獲毒6，24，48 h，SOD Bta11281基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，而 POD有4個基因在取食獲毒24 h表達(dá)量顯著升高，這說明煙粉虱取食ToCV獲毒后，體內(nèi)免疫反應(yīng)被激活，大量保護(hù)酶被合成。而CAT在4個獲毒時間點的基因表達(dá)量均無顯著差異，說明SOD和POD發(fā)揮主要保護(hù)功能。熒光定量PCR驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果大體一致，但一些基因在個別時間點下的定量PCR分析與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果不同，這可能是由于2種技術(shù)的檢測原理、敏感性、差異表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)以及操作人員技術(shù)水平不同導(dǎo)致的。

本研究發(fā)現(xiàn)，諸多解毒酶和保護(hù)酶基因在煙粉虱取食ToCV侵染番茄前后發(fā)生差異表達(dá)，但其在基因功能和代謝通路上沒有明顯差異。然而通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，煙粉虱獲毒后12 h差異基因參與的細(xì)胞組分、分子功能、生物過程與其他3個時間點顯著不同，涉及表皮結(jié)構(gòu)組成和唾液腺細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡的生物學(xué)過程存在組間顯著性差異，且注釋上的基因顯著上調(diào)；而其他時間點的差異表達(dá)基因主要富集在氨基酸、蛋白質(zhì)的生物合成上。KEGG代謝通路分析表明，溶酶體途徑僅在這一時間出現(xiàn)顯著差異，涉及基因主要編碼組織蛋白酶和硫酸酯酶。當(dāng)煙粉虱取食ToCV侵染番茄后，病毒首先隨著植物汁液經(jīng)過煙粉虱的口針，然后進(jìn)入食道，穿過中腸進(jìn)入血淋巴，最后侵染唾液腺并隨著唾液一起分泌至健康番茄植株中。He等[31]研究發(fā)現(xiàn)，番茄黃曲葉病毒可在煙粉虱唾液腺內(nèi)復(fù)制，唾液腺細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡會導(dǎo)致唾液腺組織降解，這個過程可能與病毒侵染有關(guān)。而本研究在24，48 h并未再發(fā)現(xiàn)有基因注釋到此過程，說明唾液腺降解只是一個短暫過程。通常情況下，唾液腺細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡只出現(xiàn)在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中的幼蟲階段，且是在一個完全封閉的蛹體內(nèi)進(jìn)行[32]，但成蟲體內(nèi)未見相關(guān)報道，此為本研究的首次發(fā)現(xiàn)。將注釋到該過程的基因進(jìn)行追溯，發(fā)現(xiàn)均為組織蛋白酶F。組織蛋白酶是一個龐大的蛋白家族，主要存在于溶酶體中，發(fā)揮蛋白質(zhì)降解功能。組織蛋白酶F參與MHC‖調(diào)節(jié)的抗原呈現(xiàn)作用，是機(jī)體免疫的一種機(jī)制。因此，該過程可能與煙粉虱調(diào)控自身免疫狀態(tài)應(yīng)對病毒入侵有關(guān)。

關(guān)于煙粉虱取食ToCV侵染番茄的轉(zhuǎn)錄組研究已有報道[21，33-34]，但取食時間點主要集中在24，48 h。本研究進(jìn)行了6，12，24，48 h 4個時間的轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙粉虱在應(yīng)對ToCV感染過程中基因活躍度并不是持續(xù)增強(qiáng)或持續(xù)降低，而是有一個轉(zhuǎn)折點即12 h。該時間點下，煙粉虱體內(nèi)包括解毒酶、保護(hù)酶在內(nèi)的防御基因數(shù)量、轉(zhuǎn)錄水平最低，基因功能上也呈現(xiàn)出與其他時間點截然相反的結(jié)果。由此可見，煙粉虱取食ToCV侵染番茄可能引起了其解毒酶、保護(hù)酶基因表達(dá)的改變，并通過溶酶體途徑調(diào)控自身免疫應(yīng)對ToCV入侵。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明煙粉虱取食ToCV獲毒后的防御機(jī)制，豐富煙粉虱-植物病毒-寄主植物間的互作理論，為田間ToCV的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。