萬麗嬙，李光達(dá)，和秋蘭，王正維，張 航，海梅榮

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650201)

褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺，Melatonin)是一種吲哚胺類激素，可參與調(diào)節(jié)動(dòng)物晝夜節(jié)律，改善睡眠，調(diào)節(jié)性行為和視網(wǎng)膜生理，提高機(jī)體免疫功能，減緩機(jī)體衰老，治療癌癥等[1-3]。Van Tassel和O′Neill[4]采用放射性免疫測(cè)定法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法首次在高等植物牽牛花和番茄果實(shí)中檢測(cè)到褪黑素，自此打開了植物褪黑素的研究之門。褪黑素可以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，調(diào)控光合效率及葉片衰老，增強(qiáng)植物對(duì)冷熱、滲透、氧化、病菌等脅迫的耐受性[5-7]。

近年來，隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展和人類活動(dòng)的增加，大氣中臭氧的含量日益減少。臭氧減少后將導(dǎo)致到達(dá)地面的UV-B輻射增加，從而對(duì)地面植物產(chǎn)生重要的影響，成為公認(rèn)的全球十大環(huán)境問題之一。UV-B輻射除對(duì)生物體產(chǎn)生毒害作用外，UV-B 輻射增強(qiáng)可以使植物植株矮化、葉面積減少、發(fā)育遲緩、光合作用和蒸騰作用下降、影響各種酶活性、產(chǎn)量降低、作物品質(zhì)發(fā)生變化、影響整個(gè)植物生態(tài)系統(tǒng)[8-11]。

已有研究證明，UV-B輻射會(huì)對(duì)馬鈴薯的形態(tài)和生理產(chǎn)生不良影響。增強(qiáng)的UV-B 輻射使馬鈴薯株高降低、節(jié)距縮短、葉面積減小、葉片解剖結(jié)構(gòu)不同程度增厚；非腺毛的密度和葉片氣孔增加明顯，腺毛有增多趨勢(shì)，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度等參數(shù)均受到抑制，光能利用效率明顯降低，葉片中過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶活性均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，總?cè)~綠素含量持續(xù)降低，丙二醛含量逐漸增加[12-14]。也有研究表明，褪黑素能有效緩解UV-B輻射帶來的傷害。以擬南芥為試材研究褪黑素在UV-B 脅迫中的作用發(fā)現(xiàn)，UV-B使褪黑素合成酶基因SNAT、COMT和ASMT的表達(dá)量升高[15]。在UV-B輻射條件下對(duì)湖北海棠施加褪黑素發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L的褪黑素溶液能顯著減輕UV-B輻射對(duì)光合參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、氣孔開度、葉綠素含量和葉片膜損傷的抑制作用，褪黑素處理還與UV-B脅迫下葉片抗氧化酶(抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶和過氧化物酶)活性和表達(dá)的提高以及H2O2含量的下降有關(guān)，在UV-B脅迫下，綠原酸、根皮苷和槲皮素-3-半乳糖苷等酚類物質(zhì)的含量也有所增加，而褪黑激素的加入使這些酚類化合物的含量進(jìn)一步升高[16]。

目前，褪黑素應(yīng)用于馬鈴薯的研究主要集中在應(yīng)對(duì)馬鈴薯晚疫病，研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可抑制馬鈴薯晚疫病菌絲生長，改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，降低其抗逆能力，顯著減輕馬鈴薯晚疫病。褪黑素與殺菌劑對(duì)馬鈴薯晚疫病的協(xié)同抗真菌作用表明，褪黑素可降低劑量水平，提高殺菌劑對(duì)馬鈴薯晚疫病的防治效果[17-18]。但是，尚未有研究報(bào)道UV-B輻射下褪黑素對(duì)馬鈴薯光合特性等的影響。因此，本研究采用不同濃度的褪黑素處理不同UV-B輻射下馬鈴薯幼苗，測(cè)定植株高度、光合特性、熒光特性、Rubisco活性和PEPC活性，擬探討UV-B輻射下褪黑素對(duì)馬鈴薯的響應(yīng)機(jī)制，為揭示UV-B輻射下褪黑素對(duì)馬鈴薯植株的防御機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地及試驗(yàn)品種

在云南省昆明市北郊(25°08′N，102°45′E)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，該試驗(yàn)地海拔1 966 m，年平均溫度15.1 ℃，降水以降雨為主，年降雨量1 000 mm，1 a內(nèi)干濕季分明，年平均蒸發(fā)量為175.1 mm，平均相對(duì)濕度為74%，全年無霜期341 d。試驗(yàn)品種為合作88馬鈴薯。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究于2020年5-9月進(jìn)行，盆栽中使用的土壤基質(zhì)為泥炭土與蛭石2∶1比例加水?dāng)嚢柚瞥桑ㄅ璐笮楦叨?0 cm，底部直徑27 cm，內(nèi)徑31 cm，外徑38 cm，在花盆的中央播種萌芽種薯1個(gè)，使用1/5霍格蘭營養(yǎng)液澆灌，待苗長至15 cm時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)處理。

褪黑素設(shè)置6個(gè)濃度：0，25，50，100，150，200 μmol/L。選用波長為290～320 nm的紫外線燈管進(jìn)行UV-B輻射，輻射劑量用VLX-3W 紫外輻射計(jì)(法國RADIOMETER 公司生產(chǎn)，標(biāo)準(zhǔn)帶寬為295～395 nm，中心波長312 nm)測(cè)定，燈管位于植株上方。設(shè)置4個(gè)輻射強(qiáng)度：T0為太陽光自然照射、T1=2.5 KJ/(m2·d)、T2=5.0 KJ/(m2·d)、T3=7.5 KJ/(m2·d)，隨著植株的長高調(diào)整燈管高度以保持整個(gè)輻照期間輻射劑量一致，對(duì)照組在植株上方安裝空燈架，使得對(duì)照和處理之間的自然光照條件一致。

盆栽放置位置如圖1所示。每個(gè)處理3株，重復(fù)3次，即每個(gè)輻射強(qiáng)度下放置18盆馬鈴薯，每3盆為一個(gè)處理，澆一個(gè)濃度的褪黑素溶液，一共216盆。每天10：00-15：00 進(jìn)行5 h 的輻照處理(陰雨天除外)，每隔2 d用紫外輻射計(jì)測(cè)定輻射強(qiáng)度，調(diào)整燈管與馬鈴薯之間的距離，同時(shí)花盆旋轉(zhuǎn)90°保證植株接受輻照的均勻性。處理14 d后取馬鈴薯幼苗倒三葉進(jìn)行試驗(yàn)。

A.T0處理；B.T1處理；C.T2處理；D.T3處理；a.不含褪黑素的營養(yǎng)液澆灌；b.含25 μmol/L褪黑素的營養(yǎng)液澆灌；c.含50 μmol/L褪黑素的營養(yǎng)液澆灌；d.含100 μmol/L褪黑素的營養(yǎng)液澆灌；e.含150 μmol/L褪黑素的營養(yǎng)液澆灌；f.含200 μmol/L褪黑素的營養(yǎng)液澆灌。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

采用標(biāo)尺測(cè)定株高；使用Li-6400XT光合-熒光儀(Li-Cor，美國)測(cè)定光合參數(shù)；使用DualPAM-100測(cè)量系統(tǒng)(Walz，德國)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定；采用分光光度法測(cè)定Rubisco和PEPC活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0(SPSS，美國芝加哥)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用單因素方差(One-way ANOVA)分析法，處理間均值比較使用Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著分析，當(dāng)P<0.05為差異顯著；用Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對(duì)UV-B輻射下馬鈴薯株高的影響

由表1可以看出，增強(qiáng)UV-B輻射可降低馬鈴薯植株的高度，在增強(qiáng)UV-B輻射下褪黑素可在一定程度內(nèi)提高株高。在相同增強(qiáng)UV-B輻射不同褪黑素濃度處理下：T0和T1條件下，25 μmol/L褪黑素濃度澆灌下的馬鈴薯植株最高；T2條件下50 μmol/L褪黑素濃度澆灌下的馬鈴薯植株最高；T3條件下100 μmol/L褪黑素濃度澆灌下的馬鈴薯植株最高。在相同褪黑素濃度不同增強(qiáng)UV-B輻射處理下：不施加褪黑素時(shí)T1條件下馬鈴薯植株最高；施加褪黑素時(shí)T1條件下5個(gè)濃度處理的馬鈴薯株高比其他光照條件下相同褪黑素處理的馬鈴薯植株都高。綜合2種處理?xiàng)l件，在T1條件下，施加25 μmol/L褪黑素濃度時(shí)，馬鈴薯植株最高。

2.2 外源褪黑素對(duì)UV-B輻射下馬鈴薯光合參數(shù)的影響

由圖2可以看出，增強(qiáng)UV-B輻射可降低馬鈴薯的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)，當(dāng)施加褪黑素后可以在一定程度內(nèi)提高這些光合參數(shù)。在相同增強(qiáng)UV-B輻射不同褪黑素濃度處理下：T0條件下25 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯植株P(guān)n最高，T1和 T2條件下50 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯植株P(guān)n最高，T3條件下100 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯植株P(guān)n最高；由于氣孔導(dǎo)度會(huì)影響胞間CO2濃度和蒸騰速率，所以三者的變化趨勢(shì)相同，T0條件下25 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯植株Gs、Ci、Tr最高，T1和 T2條件下50 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯植株Gs、Ci、Tr最高，T3條件下100 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯植株Gs、Ci、Tr最高。在相同褪黑素濃度不同增強(qiáng)UV-B輻射處理下：在不施加褪黑素和25 μmol/L褪黑素濃度處理，T0條件下馬鈴薯植株的Pn、Gs、Ci、Tr最高；在其他褪黑素濃度處理下，T1條件下的馬鈴薯Pn、Gs、Ci、Tr最高。綜合兩種處理?xiàng)l件，在T0條件下，施加25 μmol/L褪黑素濃度時(shí)，馬鈴薯的Pn、Gs、Ci、Tr最高。

表1 外源褪黑素對(duì)UV-B輻射下馬鈴薯株高的影響Tab.1 Effects of exogenous melatonin on plant height of potato under UV-B radiation cm

圖2 外源褪黑素對(duì)馬鈴薯光合參數(shù)的影響Fig.2 Effect of exogenous melatonin on photosynthetic parameters of potato

2.3 外源褪黑素對(duì)UV-B輻射下馬鈴薯熒光參數(shù)的影響

由圖3可以看出，增強(qiáng)UV-B輻射可降低馬鈴薯的最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)、表觀電子傳遞速率(ETR)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)，當(dāng)施加褪黑素后可以在一定程度內(nèi)提高這些熒光參數(shù)；增強(qiáng)UV-B輻射可提高馬鈴薯的非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)，施加褪黑素后可使其減少。在相同增強(qiáng)UV-B輻射不同褪黑素濃度處理下：T0條件下Fv/Fm的差異不顯著，T1條件下25，50 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯Fv/Fm最高，T2條件下50 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯Fv/Fm最高，T3條件下100 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯Fv/Fm最高；T0條件下和T1條件下25 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯ETR最高，T2條件下50 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯ETR最高，T3條件下100 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯ETR最高；T0和T1條件下25 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯qP最高，T2條件下50 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯qP最高，T3條件下100 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯qP最高；T0條件下0，25 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯NPQ最低，T1條件下25 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯NPQ最低，T2條件下50 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯NPQ最低，T3條件下100 μmol/L褪黑素濃度處理的馬鈴薯NPQ最低。在相同褪黑素濃度不同增強(qiáng)UV-B輻射處理下：無論褪黑素的濃度如何，T0條件下的Fv/Fm、ETR都最高；除T1、T2條件下50 μmol/L褪黑素濃度處理下qP高于其他UV-B輻射的qP外，其他的褪黑素濃度處理下都是自然光照條件下的qP最高；除T1條件下200 μmol/L褪黑素濃度處理時(shí)NPQ低于其他UV-B輻射的NPQ外，其他的褪黑素濃度處理下都是T0條件下的NPQ最低。綜合2種處理?xiàng)l件，在T0和T1條件下，施加25，50 μmol/L褪黑素濃度時(shí)，馬鈴薯的Fv/Fm最高；在T0條件下，施加25 μmol/L褪黑素濃度時(shí)，馬鈴薯的ETR最高；在T0條件下，施加25 μmol/L褪黑素濃度時(shí)，馬鈴薯的qP最高；在T0條件下，施加0，25 μmol/L褪黑素濃度時(shí)，馬鈴薯的NPQ最低。

不同字母表示不同處理具有顯著差異(P<0.05，Tukey test) 。圖4-5同。Different letters indicate significant difference among treatments (P<0. 05,Tukey test).The same as Fig.4-5.

2.4 外源褪黑素對(duì)UV-B輻射下馬鈴薯主要光合酶的影響

2.4.1 外源褪黑素對(duì)Rubisco的影響 由圖4可以看出，UV-B增強(qiáng)后，Rubisco活性降低，施加外源褪黑素后能在一定程度內(nèi)增強(qiáng)其活性。在相同增強(qiáng)UV-B輻射不同褪黑素濃度處理下：T0和T1條件下，施加50 μmol/L褪黑素時(shí)Rubisco活性最高；T2和T3條件下，施加100 μmol/L褪黑素時(shí)Rubisco活性最高。在相同褪黑素濃度不同增強(qiáng)UV-B輻射處理下：不施加褪黑素和施加25 μmol/L褪黑素時(shí)，T0條件下Rubisco活性最高；施加50，100，150，200 μmol/L褪黑素時(shí)，都是T1條件下Rubisco活性最高。綜合2種處理?xiàng)l件，T1條件下施加50 μmol/L褪黑素時(shí)Rubisco活性最高。

圖4 外源褪黑素對(duì)馬鈴薯1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的影響Fig.4 Effect of exogenous melatonin on potato1，5-bisphosphate ribulose carboxylase

2.4.2 外源褪黑素對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的影響 由圖5可以看出，UV-B增強(qiáng)后，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性降低，施加外源褪黑素后能在一定程度內(nèi)增強(qiáng)其活性。在相同增強(qiáng)UV-B輻射不同褪黑素濃度處理下：T0和T1條件下，施加25 μmol/L褪黑素時(shí)PEPC活性最高；T2和T3條件下，施加50 μmol/L褪黑素時(shí)PEPC活性最高。在相同褪黑素濃度不同增強(qiáng)UV-B輻射處理下：不施加褪黑素時(shí)，T0條件下PEPC活性最高；施加25，50，100，150 μmol/L褪黑素時(shí)，都是T1條件下PEPC活性最高；施加200 μmol/L褪黑素時(shí)，T0條件下PEPC活性最高。綜合2種處理?xiàng)l件，T1條件下施加25 μmol/L褪黑素時(shí)PEPC活性最高。

圖5 外源褪黑素對(duì)馬鈴薯磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的影響Fig.5 Effect of exogenous melatonin on potato phosphatepyruvate carboxylase

3 討論與結(jié)論

UV-B輻射既可以使植物的表型發(fā)生改變，也會(huì)使植物自身產(chǎn)生有毒性的活性氧自由基，這些活性氧自由基會(huì)攻擊植物的DNA、核酸、蛋白質(zhì)等，導(dǎo)致植物光合速率下降，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞自溶[19-21]。褪黑素具有極強(qiáng)的抗氧化能力，其抗氧化能力高于抗壞血酸、生育酚、谷胱甘肽等抗氧化劑，它能夠清除羥基自由基、羰基自由基等活性氧自由基及一些活性氮自由基，還能通過激發(fā)抗氧化酶的生物合成來提高細(xì)胞的抗氧化能力，以此緩解環(huán)境脅迫及生物脅迫對(duì)高等植物造成的損傷，加強(qiáng)植物抗逆性[22]。

黃益宗等[23]在研究外源褪黑素對(duì)砷脅迫下水稻幼苗生長的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，砷脅迫下施加褪黑素可增高水稻高度；鄒京南等[24]在研究外源褪黑素對(duì)干旱脅迫條件下大豆苗期光合及生理的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，褪黑素能緩解干旱脅迫下大豆株高的減少；侯雯等[25]在研究外源褪黑素對(duì)低溫脅迫下玉米幼苗生長和生理特性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，褪黑素有利于緩解低溫脅迫對(duì)玉米幼苗株高的影響。以上研究表明，褪黑素能緩解非生物脅迫對(duì)植物株高的影響。馬鈴薯受到增強(qiáng)UV-B輻射后株高明顯降低，施加褪黑素后該現(xiàn)象得到改善。在T1條件下，施加25 μmol/L褪黑素濃度時(shí)，馬鈴薯植株最高，研究結(jié)果與上述研究結(jié)果類似。

光合作用影響植物生長發(fā)育過程。光合作用的主要影響因素是光照，光照主要通過光照強(qiáng)度、光質(zhì)和光照時(shí)間3種形式對(duì)植物的生長發(fā)育和形態(tài)變化進(jìn)行調(diào)節(jié)和影響[26]。作為植物進(jìn)行光合作用的重要外部環(huán)境因素，不同的光照強(qiáng)度對(duì)植物光合作用和生長產(chǎn)生不同的影響。Pn、Ci、Tr、Gs是光合作用的重要指標(biāo)，可以反映植物的光合能力強(qiáng)弱。本試驗(yàn)中馬鈴薯各個(gè)光合參數(shù)的變化趨勢(shì)相同，增強(qiáng)UV-B輻射會(huì)降低光合參數(shù)，施加褪黑素后各個(gè)參數(shù)有所增加，在自然光照條件下，施加25 μmol/L褪黑素濃度時(shí)各指標(biāo)最優(yōu)，說明一定的褪黑素濃度和UV-B輻射能提高馬鈴薯的光合能力。

葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)反映光能的吸收和轉(zhuǎn)化、能量的傳遞與分配、反應(yīng)中心的活性，以及光合作用的光抑制與光破壞狀態(tài)等光合系統(tǒng)的“內(nèi)在性特點(diǎn)”[27]。Fv/Fm是PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映PSⅡ的潛在活性[28]，受到脅迫時(shí)該值會(huì)降低；ETR越高說明葉片細(xì)胞的相對(duì)光合電子傳遞能力較強(qiáng)；qP是光化學(xué)淬滅即PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額，一定程度上qP也反映了PS Ⅱ反應(yīng)中心開放的程度；NPQ是非光化學(xué)淬滅，是植物的一種保護(hù)機(jī)制，PS Ⅱ天線色素吸收了過量的光能而不能及時(shí)耗散時(shí)會(huì)以熱的形式耗散，否則會(huì)對(duì)光合機(jī)構(gòu)造成破壞[29]。本試驗(yàn)中Fv/Fm、qP、ETR在增強(qiáng)UV-B輻射下明顯降低，施加褪黑素后有所升高，NPQ在增強(qiáng)UV-B輻射下明顯升高，施加褪黑素后有所下降，在自然光照條件下，施加25 μmol/L褪黑素濃度時(shí)大多數(shù)參數(shù)都是最優(yōu)的。

Rubisco是植物光合作用反映固定CO2的關(guān)鍵酶，它參與光呼吸途徑，消耗光合產(chǎn)物，對(duì)提高植物的光合效率至關(guān)重要[29]；PEPC，其酶活性是Rubisco活性的60倍，對(duì) CO2親和力大，是C4植物具有高效光合作用的關(guān)鍵，研究發(fā)現(xiàn)將C4型PEPC基因?qū)隒3植物中能提高其光合效率[30]。本試驗(yàn)中Rubisco和PEPC在受到增強(qiáng)UV-B脅迫后都有所降低，施加外源褪黑素后，T1條件下施加50 μmol/L褪黑素時(shí)Rubisco活性最高，T1條件下施加25 μmol/L褪黑素時(shí)PEPC活性最高，本試驗(yàn)結(jié)果與孫建磊[31]、張振文[32]、羅璇[33]、丁在松[34]等用非生物脅迫手段處理黃瓜、木薯、小麥、谷子、水稻后Rubisco和PEPC的結(jié)果與光合、熒光參數(shù)變化結(jié)果一致。Rubisco和PEPC 2種酶活的變化趨勢(shì)與光合、熒光參數(shù)的變化趨勢(shì)一致，說明2種酶與光合作用密切相關(guān)且一定濃度的褪黑素能提高其活性。

在增強(qiáng)UV-B輻射下施加外源褪黑素能在一定程度使馬鈴薯植株增高，光合能力增強(qiáng)，Rubisco和PEPC活性提高。但隨著褪黑素濃度升高這些指標(biāo)下降，說明過高的褪黑素濃度會(huì)對(duì)植物造成損傷。