曾群章，韓琳，薛嚇娟，方藝聰

作者單位：福建省漳州市醫(yī)院，a結(jié)直腸肛門外科，b消化內(nèi)科，福建漳州363000

結(jié)直腸癌是我國第三大常見癌癥，其發(fā)病率和病死率持續(xù)上升。盡管隨著治療策略的改進，結(jié)直腸癌病人的5年生存率在過去30年已從22%提高到47%，但總體生存率仍然不夠理想。目前，根治性手術(shù)是最有效的治療方法，但是病程早期癥狀較為隱匿，難以及時診斷與治療，手術(shù)切除率不到20%，是結(jié)直腸癌病人預(yù)后差的主要原因。已有明確的證據(jù)顯示，篩查可使結(jié)直腸癌的發(fā)生率和病死率降低30%～60%。因此，需要更有效的生物標(biāo)志物預(yù)測結(jié)直腸癌的預(yù)后，并實施分層治療。

神經(jīng)突起導(dǎo)向因子-1（netrin-1）在胚胎及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮軸突導(dǎo)向功能，促進神經(jīng)細(xì)胞遷移。netrin-1除了表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)外，還在肺臟、視網(wǎng)膜等多種組織器官中表達(dá)，在炎癥調(diào)節(jié)、血管生成、腫瘤進展等方面發(fā)揮重要作用。張旭等發(fā)現(xiàn)，netrin-1在6種不同來源的結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，尤其以SW620、LOVO、LS174T結(jié)直腸癌細(xì)胞株最為顯著。但是，netrin-1在結(jié)直腸癌臨床樣本中的表達(dá)情況尚無報道，因此本研究檢測結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中netrin-1的表達(dá)情況，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據(jù)研究目的，以隨機數(shù)字表法選取2012年1月至2014年6月福建省漳州市醫(yī)院符合標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)直腸癌病人共計184例作為研究對象，均行結(jié)直腸癌根治術(shù)，術(shù)中留取癌組織樣本，并選取距腫瘤邊緣5 cm的癌旁正常組織作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)診斷證實為結(jié)直腸癌；（2）臨床病理資料完整；（3）首發(fā)腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床病理特征資料不完整的病人；（2）合并其他腫瘤的病人；（3）術(shù)前已接受放化療或生物治療的病人。收集臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤深度、分化程度、TNM分期、病理學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。TNM分期參照第7版（2010）結(jié)直腸癌美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）分期標(biāo)準(zhǔn)。所有病人均已簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 實驗方法

1.2.1

主要試劑抗netrin-1抗體購自英國Abcam公司；SP-9000通用SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、蘇木精、中性樹膠購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2

免疫組織化學(xué)染色檢測netrin-1表達(dá)將獲得的組織標(biāo)本用多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片獲得4 μm厚的石蠟切片，常規(guī)進行脫蠟、水化、抗原修復(fù)等步驟，滴加3%的過氧化氫溶液孵育10 min，然后滴加山羊血清封閉液孵育10 min。滴加抗netrin-1抗體（1∶100），4℃過夜孵育。次日洗滌后，采用SP-9000通用SP試劑盒繼續(xù)染色。DAB顯色、蘇木精復(fù)染、沖洗、脫水、中性樹膠封片。

1.2.3

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)染色結(jié)果由2名資深病理醫(yī)師雙盲獨立判斷，有分歧的病例，由第3位醫(yī)師綜合判斷。將胞質(zhì)中淡黃色、棕黃色或褐色染色作為陽性細(xì)胞，然后根據(jù)染色指數(shù)進行判斷，染色指數(shù)=染色強度積分×陽性細(xì)胞比例積分，染色指數(shù)包含8個分值，即0、1、2、4、6、8、9、12分，＞4分作為高表達(dá)，≤4分則作為低表達(dá)。高倍鏡下隨機選取5個視野，觀察染色強度：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分；對陽性細(xì)胞與總細(xì)胞進行計數(shù)，計算比例積分：＜10%為0分，10%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0進行分析。計數(shù)資料比較使用

χ

檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率比較使用log-rank檢驗，Cox比例風(fēng)險回歸模型分析預(yù)后影響因素。檢驗水準(zhǔn)

α

=0.05。

2 結(jié)果

2.1 netrin

-

1在結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，netrin-1呈淡黃色、棕黃色或褐色表達(dá)于胞質(zhì)，在癌組織中大部分為高表達(dá)，而在癌旁正常組織則不表達(dá)或低表達(dá)。癌組織與癌旁正常組織中netrin-1高表達(dá)率分別為71.7%（132/184）、9.8%（18/184），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

χ

=146.255，

P

＜0.001）。

2.2 netrin

-

1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

netrin-1高表達(dá)與浸潤深度（

P

=0.001）、TNM分期（

P

=

0.003

）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（

P

＜0.001）有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度、病理學(xué)類型無關(guān)（

P

＞0.05），見表1。

表1 神經(jīng)突起導(dǎo)向因子-1（netrin-1）表達(dá)與結(jié)直腸癌184例臨床病理特征的相關(guān)性/例

2.3 netrin

-

1表達(dá)對病人生存率的影響

netrin-1高表達(dá)病人失訪4例，低表達(dá)病人失訪2例，隨訪率為96.7%。netrin-1高表達(dá)與低表達(dá)者5年總生存率分別為40.9%（54/132）和71.2%（37/52），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

χ

=15.101，

P

＜0.001）。見圖1。

圖1 神經(jīng)突起導(dǎo)向因子-1（netrin-1）表達(dá)水平與結(jié)直腸癌184例總生存率的關(guān)系

2.4 5年總生存率的單因素與多因素分析

對結(jié)直腸癌病人5年總生存率與各臨床病理特征的關(guān)系進行分析，單因素分析結(jié)果顯示浸潤深度（

P

=0.027）、TNM分期（

P

=0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（

P

＜0.001）、netrin-1表達(dá)（

P

＜0.001）與結(jié)直腸癌病人5年總生存率相關(guān)（見表2）；將該4種因素納入Cox比例風(fēng)險回歸模型進行多因素分析，結(jié)果顯示TNM分期（

RR

=1.768，

P

=

0.023

）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（

RR

=1.946，

P

=0.008）、netrin-1表達(dá)（

RR

=1.959，

P

=0.039）是結(jié)直腸癌病人的獨立預(yù)后因素（見表3）。

表2 結(jié)直腸癌184例5年總生存率的單因素分析

表3 結(jié)直腸癌184例5年總生存率的Cox多因素分析

3 討論

Netrin-1是一種多功能的分泌糖蛋白，在神經(jīng)發(fā)育、血管生成等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此Ne-trin-1與多種疾病密切相關(guān)，包括糖尿病、動脈粥樣硬化、癌癥等。多項研究證實，netrin-1在部分癌癥中表達(dá)上調(diào)，可阻止其依賴受體結(jié)直腸癌缺失蛋白（DCC）和UNC5同源蛋白（UNC5H）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，如Harter等報道，netrin-1在腦轉(zhuǎn)移瘤中高表達(dá)是病人生存不良的獨立預(yù)后因素。因此，對血液或尿液中的netrin-1含量進行檢測已被提議作為癌癥的預(yù)測指標(biāo)，其與其受體相互作用的抑制藥物也已開始研發(fā)，一種人源化的抗netrin-1抗體，也被稱為NP137，目前處于I期臨床試驗中。盡管如此，netrin-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。

本研究通過對癌組織及癌旁正常組織進行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，netrin-1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在癌組織中大部分為高表達(dá)，而在癌旁正常組織則不表達(dá)或低表達(dá)，癌組織中netrin-1高表達(dá)率為71.7%（132/184），顯著高于癌旁正常組織9.8%（18/184）。該結(jié)果與張旭等在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)的趨勢一致，提示其高表達(dá)可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。進一步分析netrin-1表達(dá)與各臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，腫瘤的浸潤深度越深、TNM分期越晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，netrin-1表達(dá)水平越高，表明netrin-1參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，但是具體機制仍不清楚。Barallobre等認(rèn)為，netrin-1可與DCC受體相結(jié)合，使其同源二聚體化，從而將caspase-3的剪切位點封閉，抑制該信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，netrin-1還可能通過活化PI3K/AKT信號通路促進人肺腺癌A549細(xì)胞與PC9細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；netrin-1可與neogenin（neonatal protein，再生蛋白）相互作用，增強CD4T細(xì)胞的趨化作用，并引發(fā)促炎癥反應(yīng)，在腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用；netrin-1可以促進血管內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞增生、遷移與黏附，其促血管生成效應(yīng)可能是腫瘤生長的必要條件。

本研究對病人進行隨訪發(fā)現(xiàn)，netrin-1高表達(dá)者的5年總生存率為40.9%（54/132）顯著低于低表達(dá)者71.2%（37/52）。預(yù)后單因素分析結(jié)果顯示，浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、netrin-1表達(dá)與結(jié)直腸癌病人5年總生存率相關(guān)。將這4種有統(tǒng)計學(xué)意義的因素納入Cox多因素分析，結(jié)果表明TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、netrin-1表達(dá)是結(jié)直腸癌病人的獨立預(yù)后因素。因此，netrin-1表達(dá)有可能成為結(jié)直腸癌病人預(yù)后評價的生物學(xué)指標(biāo)，也為機制研究與藥物開發(fā)提供了一個新的作用靶點。

本研究的不足與展望：（1）netrin-1的依賴性受體DCC與UNC5C也在多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤病人預(yù)后密切相關(guān)，但是本研究未對netrin-1的受體進行檢測，未來需要進一步探討其受體的表達(dá)情況及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系；（2）本研究通過對臨床組織進行病理染色分析netrin-1的表達(dá)情況，但是有研究發(fā)現(xiàn)，netrin-1在腫瘤病人的血漿中也存在差異性表達(dá)，而血漿較組織樣本病理檢測具有取材簡單便捷等優(yōu)勢，對于早期診斷具有更重要的臨床意義，因此后續(xù)仍需要從血漿表達(dá)的角度進一步完善本研究結(jié)論；（3）netrin-1促進結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制仍未探討，未來需要進一步在體外細(xì)胞培養(yǎng)與移植瘤動物模型中深入研究，通過基因敲除、RNA干擾、蛋白阻斷等方法揭示netrin-1的上下游調(diào)節(jié)通路。

綜上所述，netrin-1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，其高表達(dá)可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，對預(yù)后判斷有一定的參考價值。