李剛,劉明,王太鵬
作者單位:煙臺龍礦中心醫(yī)院外四科,山東煙臺265700
骨肉瘤是兒童癌癥病人死亡的最主要原因之一。常用的治療方案為手術(shù)前后輔助化療,但其生存率仍不足20%。唑來膦酸(ZOL)在癌癥中的治療作用得到普遍認可,但其在骨肉瘤中的作用機制尚未完全清楚。miRNA為一種短鏈非編碼內(nèi)源性微小RNA,其通過抑制或沉默靶基因轉(zhuǎn)錄蛋白過程,而發(fā)揮調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展的作用。miR-520a-3p雖在其他癌癥中具有抑癌作用,但其在骨肉瘤中與唑來膦酸和T細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子7(TCF7)的調(diào)控機制尚未有人報道。本實驗旨在研究唑來膦酸對骨肉瘤細胞HOS增殖、遷移和侵襲以及其對miR-520a-3p、TCF7表達的影響,于2018年6月至2019年1月通過過表達miR-520a-3p、抑制miR-520a-3p對唑來膦酸處理的HOS細胞增殖、遷移和侵襲的影響,揭示其機制與唑來膦酸上調(diào)miR-520a-3p,抑制TCF7表達有關(guān),將為唑來膦酸治療骨肉瘤奠定理論基礎(chǔ)。
1.1 材料
人骨肉瘤細胞(HOS)購自美國ATCC;唑來膦酸(密固達,批號S0261,5 mg/100 mL)購自北京諾華制藥有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司;基質(zhì)膠、Transwell小室購自美國Coming公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司;Lipofectamine2000、BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司。1.2 方法
1.2.1
細胞培養(yǎng)以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HOS細胞,環(huán)境條件為37℃,5%二氧化碳。1.2.2
細胞轉(zhuǎn)染將ZOL(50 μmol/L)處理48 h的HOS細胞,標(biāo)記為ZOL組;未做任何處理的HOS細胞,標(biāo)記為對照組;將miR-con、miR-520a-3p mimics分別轉(zhuǎn)染到HOS細胞48 h,分別標(biāo)記為miR-con組、miR-520a-3p組;將anti-miR-con、anti-miR-520a-3p分別轉(zhuǎn)染到HOS細胞48 h,再經(jīng)50 μmol/L ZOL處理48 h,分別標(biāo)記為ZOL+anti-miR-con組、ZOL+antimiR-520a-3p組;將anti-miR-520a-3p分別與si-con、si-TCF7共 轉(zhuǎn)染 到HOS細 胞48 h,再 經(jīng)50 μmol/L ZOL處理48 h,分別標(biāo)記為ZOL+anti-miR-520a-3p+si-con組、ZOL+anti-miR-520a-3p+si-TCF7組。1.2.3
MTT法檢測細胞活性取各組細胞,加入20 μL 5 g/L的MTT溶液,培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),震蕩,使結(jié)晶溶解,檢測490 nm處的吸光度。1.2.4
Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲加入100 μL(10個/毫升)HOS細胞于Transwell小室上室,600 μL含血清的培養(yǎng)基加入下室,培養(yǎng)過夜。取出小室,棉簽擦去上室內(nèi)細胞,磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)洗滌,甲醇固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,PBS洗滌。于顯微鏡下,隨機選5個視野計遷移細胞數(shù)。在Transwell小室上表面鋪適量厚度的基質(zhì)膠,按上述操作方法計侵襲細胞數(shù)。
1.2.5
實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)檢測細胞中miR-520a-3p的表達提取各組細胞RNA,BCA定量,合成互補DNA(cDNA)后,按qRT-PCR試劑盒說明書檢測miR-520a-3p表達,用2計算miR-520a-3p表達。1.2.6
蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測細胞中TCF7的蛋白表達提取各組細胞蛋白,BCA定量,電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉將膜封閉2 h,洗膜,加入Ⅰ抗,4℃過夜孵育,洗膜,加Ⅱ抗,4℃2 h。加發(fā)光液,曝光。1.2.7
雙熒光素酶報告基因檢測實驗構(gòu)建TCF7 3’UTR-WT(含TCF7 3’UTR片段)和TCF7 3’UTRMUT(含TCF7 3’UTR片段突變體)熒光素酶報告載體,按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。2.1 唑來膦酸抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲
MTT法和Transwell實驗檢測結(jié)果如表1、圖1所示,與對照組相比,ZOL組HOS細胞在48、72 h時細胞活性,細胞遷移量和侵襲量均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P
<0.05)。圖1 Transwell檢測唑來膦酸(ZOL)對骨肉瘤細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的影響(結(jié)晶紫染色×200)
表1 唑來膦酸(ZOL)抑制骨肉瘤細胞增殖、降低細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)/±s
2.2唑來膦酸調(diào)控骨肉瘤細胞miR
-520a
-3p的表達
與對照組(1.00±0.13)相比,ZOL 10 μmol/L組(1.88±0.16)、ZOL 50 μmol/L組(4.73±0.56)、ZOL 250 μmol/L組(4.95±0.62)HOS細胞中miR-520a-3p的表達量均顯著升高(F
=64.667,P
<0.001)。2.3 過表達miR
-520a
-3p抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲
結(jié)果如表2所示,與miR-con組相比,miR-520a-3p組HOS細胞在48、72 h時,細胞活性、細胞遷移量和侵襲量顯著降低(P
<0.05)。表2 過表達miR-520a-3p抑制骨肉瘤細胞增殖以及減少細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的影響/±s
2.4 miR
-520a
-3p靶向骨肉瘤細胞TCF7檢測結(jié)果
miRcode預(yù)測 顯 示,miR-520a-3p與TCF7 3’UTR之間存在結(jié)合位點(圖2A);雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,與miR-con組(1.00±0.12)相比,miR-520a-3p組(0.42±0.06)WT-TCF7細胞中熒光活性顯著降低(t
=7.488,P
=0.002),MUT-TCF7細胞中miRcon組(0.95±0.09)與miR-520a-3p組(1.13±0.12)的熒光活性不受影響(t
=2.079,P
=0.106)。miR-con組、miR-520a-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-520a-3p組TCF7蛋白表達水平分別為(0.39±0.05)、(0.17±0.05)、(0.36±0.04)、(0.67±0.06)(F
=49.990,P
<0.001),miR-520a-3p組低于miR-con組(P
<0.05),anti-miR-520a-3p組高于anti-miR-con組(P
<0.05),說明miR-520a-3p靶向負調(diào)控TCF7表達(圖2B)(P
<0.05)。圖2 miR-520a-3p靶向調(diào)控骨肉瘤細胞T細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子7(TCF7)表達:A為miR-520a-3p與TCF7靶向的序列信息,B為miR-520a-3p對骨肉瘤細胞TCF7表達的影響
2.5 抑制miR
-520a
-3p逆轉(zhuǎn)唑來膦酸對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用
結(jié)果如表3所示,與對照組相比,ZOL組HOS細胞在48、72 h時,細胞活性、細胞遷移量和侵襲量顯著降低;與ZOL+antimiR-con組相比,ZOL+anti-miR-520a-3p組HOS細胞在48、72 h時,細胞活性、細胞遷移量和侵襲量顯著升高;與ZOL+anti-miR-520a-3p-si-con組相比,ZZOL+anti-miR-520a-3p-si-TCF7組HOS細胞 在48、72 h時,細胞活性、細胞遷移量和侵襲量均顯著降低(P
<0.05)。與對照組相比,ZOL組TCF7表達顯著降低;與ZOL組相比,ZOL+anti-miR-520a-3p組TCF7顯著升高;與ZOL+anti-miR-520a-3p-si-con組相比,ZZOL+anti-miR-520a-3p-si-TCF7組TCF7顯 著 降 低(P
<0.05)。見圖3。圖3 抑制miR-520a-3p和唑來膦酸(ZOL)對骨肉瘤細胞T細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子7(TCF7)表達的影響
表3 抑制miR-520a-3p表達可以逆轉(zhuǎn)唑來膦酸(ZOL)對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用/±s
唑來膦酸是一種雙磷酸鹽類藥物,其具有較好的臨床療效,尤其針對發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的癌癥。李欣曉等在唑來膦酸治療骨轉(zhuǎn)移惡性腫瘤的研究中闡明,唑來膦酸聯(lián)合放射治療可增強發(fā)生骨轉(zhuǎn)移腫瘤的治療效果,其機制與失活腫瘤信號通路、促進凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等相關(guān)。早在2007年,何賢峰等、劉家國等已報道,唑來膦酸可通過抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲,促進其凋亡,抑制骨肉瘤的進一步惡化。最近冷華平等在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn),唑來膦酸可通過調(diào)節(jié)COX-2(環(huán)氧合酶-2)、MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)和TIMP1(金屬蛋白酶組織抑制因子-1)的表達呈濃度依賴性抑制骨肉瘤細胞的惡性生物學(xué)行為。本研究發(fā)現(xiàn),唑來膦酸可明顯抑制HOS細胞增殖、遷移、侵襲,這與前人的研究結(jié)果均相似;且唑來膦酸可上調(diào)HOS細胞中miR-520a-3p的表達。
現(xiàn)普遍認為,miRNA能調(diào)控mRNA的翻譯或降解,從而影響蛋白的表達。miRNA可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的進展過程。在乳腺癌組織和細胞中,miR-520a-3p表達顯著下調(diào),恢復(fù)miR-520a-3p表達通過下調(diào)CCND1和CD44抑制乳腺癌進展。過表達miR-520a-3p通過靶向下調(diào)EGFR抑制結(jié)直腸癌細胞遷移,促進細胞凋亡,并阻滯細胞周期于G/G期,抑制腫瘤生長。Wang等在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn),右美托咪定可上調(diào)直接靶向蛋白激酶1(AKT1)的miR-520a-3p,miR-520a-3p可抑制MG63細胞增殖和遷移,促進細胞凋亡,揭示右美托咪定可通過上調(diào)miR-520a-3p的表達水平來抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移并促進細胞凋亡,提示右美托咪定可以作為骨肉瘤治療中的潛在治療劑,且miR-520a-3p可以是骨肉瘤治療中的潛在靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn),過表達miR-520a-3p可抑制HOS細胞的增殖、遷移、侵襲;深入研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-520a-3p可逆轉(zhuǎn)唑來膦酸對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,且miR-520a-3p可靶向負調(diào)控TCF7表達,推測miR-520a-3p的功能可能與靶向TCF7存在一定相關(guān)性。
TCF7為高遷移率蛋白超家族成員,主要參與調(diào)控淋巴細胞的分化。其在多種腫瘤中均出現(xiàn)表達異常升高,參與腫瘤的惡性進程。TCF7在結(jié)直腸癌組織和細胞中高表達,敲除TCF7可顯著抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲。在骨肉瘤組織和細胞中,TCF7蛋白過表達,過表達miR-192通過靶向下調(diào)TCF7抑制骨肉瘤細胞的惡性行為。本研究檢測了唑來膦酸處理的HOS細胞中TCF7的表達發(fā)現(xiàn),唑來膦酸可抑制TCF7的表達;深入研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-520a-3p可逆轉(zhuǎn)唑來膦酸在HOS細胞中對TCF7表達的抑制作用,敲減TCF7逆轉(zhuǎn)了抑制miR-520a-3p對唑來膦酸的骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響。
綜上所述,唑來膦酸可能通過調(diào)控miR-520a-3p/TCF7軸抑制骨肉瘤HOS細胞的增殖、遷移和侵襲,為骨肉瘤治療提供理論基礎(chǔ)。