李剛，劉明，王太鵬

作者單位：煙臺(tái)龍礦中心醫(yī)院外四科，山東煙臺(tái)265700

骨肉瘤是兒童癌癥病人死亡的最主要原因之一。常用的治療方案為手術(shù)前后輔助化療，但其生存率仍不足20%。唑來(lái)膦酸（ZOL）在癌癥中的治療作用得到普遍認(rèn)可，但其在骨肉瘤中的作用機(jī)制尚未完全清楚。miRNA為一種短鏈非編碼內(nèi)源性微小RNA，其通過抑制或沉默靶基因轉(zhuǎn)錄蛋白過程，而發(fā)揮調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展的作用。miR-520a-3p雖在其他癌癥中具有抑癌作用，但其在骨肉瘤中與唑來(lái)膦酸和T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子7（TCF7）的調(diào)控機(jī)制尚未有人報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究唑來(lái)膦酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞HOS增殖、遷移和侵襲以及其對(duì)miR-520a-3p、TCF7表達(dá)的影響，于2018年6月至2019年1月通過過表達(dá)miR-520a-3p、抑制miR-520a-3p對(duì)唑來(lái)膦酸處理的HOS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，揭示其機(jī)制與唑來(lái)膦酸上調(diào)miR-520a-3p，抑制TCF7表達(dá)有關(guān)，將為唑來(lái)膦酸治療骨肉瘤奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤細(xì)胞（HOS）購(gòu)自美國(guó)ATCC；唑來(lái)膦酸（密固達(dá)，批號(hào)S0261，5 mg/100 mL）購(gòu)自北京諾華制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、噻唑藍(lán)（MTT）、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sellect公司；基質(zhì)膠、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coming公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Lipofectamine2000、BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連Takara公司。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HOS細(xì)胞，環(huán)境條件為37℃，5%二氧化碳。

1.2.2

細(xì)胞轉(zhuǎn)染將ZOL（50 μmol/L）處理48 h的HOS細(xì)胞，標(biāo)記為ZOL組；未做任何處理的HOS細(xì)胞，標(biāo)記為對(duì)照組；將miR-con、miR-520a-3p mimics分別轉(zhuǎn)染到HOS細(xì)胞48 h，分別標(biāo)記為miR-con組、miR-520a-3p組；將anti-miR-con、anti-miR-520a-3p分別轉(zhuǎn)染到HOS細(xì)胞48 h，再經(jīng)50 μmol/L ZOL處理48 h，分別標(biāo)記為ZOL+anti-miR-con組、ZOL+antimiR-520a-3p組；將anti-miR-520a-3p分別與si-con、si-TCF7共 轉(zhuǎn)染 到HOS細(xì) 胞48 h，再 經(jīng)50 μmol/L ZOL處理48 h，分別標(biāo)記為ZOL+anti-miR-520a-3p+si-con組、ZOL+anti-miR-520a-3p+si-TCF7組。

1.2.3

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性取各組細(xì)胞，加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩，使結(jié)晶溶解，檢測(cè)490 nm處的吸光度。

1.2.4

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲加入100 μL（10個(gè)/毫升）HOS細(xì)胞于Transwell小室上室，600 μL含血清的培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)過夜。取出小室，棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌。于顯微鏡下，隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。

在Transwell小室上表面鋪適量厚度的基質(zhì)膠，按上述操作方法計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)細(xì)胞中miR-520a-3p的表達(dá)提取各組細(xì)胞RNA，BCA定量，合成互補(bǔ)DNA（cDNA）后，按qRT-PCR試劑盒說明書檢測(cè)miR-520a-3p表達(dá)，用2計(jì)算miR-520a-3p表達(dá)。

1.2.6

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)細(xì)胞中TCF7的蛋白表達(dá)提取各組細(xì)胞蛋白，BCA定量，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.2.7

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建TCF7 3’UTR-WT（含TCF7 3’UTR片段）和TCF7 3’UTRMUT（含TCF7 3’UTR片段突變體）熒光素酶報(bào)告載體，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 唑來(lái)膦酸抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

MTT法和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果如表1、圖1所示，與對(duì)照組相比，ZOL組HOS細(xì)胞在48、72 h時(shí)細(xì)胞活性，細(xì)胞遷移量和侵襲量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。

圖1 Transwell檢測(cè)唑來(lái)膦酸（ZOL）對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的影響（結(jié)晶紫染色×200）

表1 唑來(lái)膦酸（ZOL）抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)/±s

2.2唑來(lái)膦酸調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞miR

-

520a

-

3p的表達(dá)

與對(duì)照組（1.00±0.13）相比，ZOL 10 μmol/L組（1.88±0.16）、ZOL 50 μmol/L組（4.73±0.56）、ZOL 250 μmol/L組（4.95±0.62）HOS細(xì)胞中miR-520a-3p的表達(dá)量均顯著升高（

F

=64.667，

P

＜0.001）。

2.3 過表達(dá)miR

-

520a

-

3p抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

結(jié)果如表2所示，與miR-con組相比，miR-520a-3p組HOS細(xì)胞在48、72 h時(shí)，細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移量和侵襲量顯著降低（

P

＜0.05）。

表2 過表達(dá)miR-520a-3p抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖以及減少細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的影響/±s

2.4 miR

-

520a

-

3p靶向骨肉瘤細(xì)胞TCF7檢測(cè)結(jié)果

miRcode預(yù)測(cè) 顯 示，miR-520a-3p與TCF7 3’UTR之間存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）；雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-con組（1.00±0.12）相比，miR-520a-3p組（0.42±0.06）WT-TCF7細(xì)胞中熒光活性顯著降低（

t

=7.488，

P

=0.002），MUT-TCF7細(xì)胞中miRcon組（0.95±0.09）與miR-520a-3p組（1.13±0.12）的熒光活性不受影響（

t

=2.079，

P

=0.106）。miR-con組、miR-520a-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-520a-3p組TCF7蛋白表達(dá)水平分別為（0.39±0.05）、（0.17±0.05）、（0.36±0.04）、（0.67±0.06）（

F

=49.990，

P

＜0.001），miR-520a-3p組低于miR-con組（

P

＜0.05），anti-miR-520a-3p組高于anti-miR-con組（

P

＜0.05），說明miR-520a-3p靶向負(fù)調(diào)控TCF7表達(dá)（圖2B）（

P

＜0.05）。

圖2 miR-520a-3p靶向調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子7（TCF7）表達(dá)：A為miR-520a-3p與TCF7靶向的序列信息，B為miR-520a-3p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞TCF7表達(dá)的影響

2.5 抑制miR

-

520a

-

3p逆轉(zhuǎn)唑來(lái)膦酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

結(jié)果如表3所示，與對(duì)照組相比，ZOL組HOS細(xì)胞在48、72 h時(shí)，細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移量和侵襲量顯著降低；與ZOL+antimiR-con組相比，ZOL+anti-miR-520a-3p組HOS細(xì)胞在48、72 h時(shí)，細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移量和侵襲量顯著升高；與ZOL+anti-miR-520a-3p-si-con組相比，ZZOL+anti-miR-520a-3p-si-TCF7組HOS細(xì)胞 在48、72 h時(shí)，細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移量和侵襲量均顯著降低（

P

＜0.05）。與對(duì)照組相比，ZOL組TCF7表達(dá)顯著降低；與ZOL組相比，ZOL+anti-miR-520a-3p組TCF7顯著升高；與ZOL+anti-miR-520a-3p-si-con組相比，ZZOL+anti-miR-520a-3p-si-TCF7組TCF7顯 著 降 低（

P

＜0.05）。見圖3。

圖3 抑制miR-520a-3p和唑來(lái)膦酸（ZOL）對(duì)骨肉瘤細(xì)胞T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子7（TCF7）表達(dá)的影響

表3 抑制miR-520a-3p表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)唑來(lái)膦酸（ZOL）對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用/±s

3 討論

唑來(lái)膦酸是一種雙磷酸鹽類藥物，其具有較好的臨床療效，尤其針對(duì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的癌癥。李欣曉等在唑來(lái)膦酸治療骨轉(zhuǎn)移惡性腫瘤的研究中闡明，唑來(lái)膦酸聯(lián)合放射治療可增強(qiáng)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移腫瘤的治療效果，其機(jī)制與失活腫瘤信號(hào)通路、促進(jìn)凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等相關(guān)。早在2007年，何賢峰等、劉家國(guó)等已報(bào)道，唑來(lái)膦酸可通過抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)其凋亡，抑制骨肉瘤的進(jìn)一步惡化。最近冷華平等在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，唑來(lái)膦酸可通過調(diào)節(jié)COX-2（環(huán)氧合酶-2）、MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶9）和TIMP1（金屬蛋白酶組織抑制因子-1）的表達(dá)呈濃度依賴性抑制骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本研究發(fā)現(xiàn)，唑來(lái)膦酸可明顯抑制HOS細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，這與前人的研究結(jié)果均相似；且唑來(lái)膦酸可上調(diào)HOS細(xì)胞中miR-520a-3p的表達(dá)。

現(xiàn)普遍認(rèn)為，miRNA能調(diào)控mRNA的翻譯或降解，從而影響蛋白的表達(dá)。miRNA可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的進(jìn)展過程。在乳腺癌組織和細(xì)胞中，miR-520a-3p表達(dá)顯著下調(diào)，恢復(fù)miR-520a-3p表達(dá)通過下調(diào)CCND1和CD44抑制乳腺癌進(jìn)展。過表達(dá)miR-520a-3p通過靶向下調(diào)EGFR抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并阻滯細(xì)胞周期于G/G期，抑制腫瘤生長(zhǎng)。Wang等在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可上調(diào)直接靶向蛋白激酶1（AKT1）的miR-520a-3p，miR-520a-3p可抑制MG63細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，揭示右美托咪定可通過上調(diào)miR-520a-3p的表達(dá)水平來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示右美托咪定可以作為骨肉瘤治療中的潛在治療劑，且miR-520a-3p可以是骨肉瘤治療中的潛在靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-520a-3p可抑制HOS細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲；深入研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-520a-3p可逆轉(zhuǎn)唑來(lái)膦酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，且miR-520a-3p可靶向負(fù)調(diào)控TCF7表達(dá)，推測(cè)miR-520a-3p的功能可能與靶向TCF7存在一定相關(guān)性。

TCF7為高遷移率蛋白超家族成員，主要參與調(diào)控淋巴細(xì)胞的分化。其在多種腫瘤中均出現(xiàn)表達(dá)異常升高，參與腫瘤的惡性進(jìn)程。TCF7在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，敲除TCF7可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。在骨肉瘤組織和細(xì)胞中，TCF7蛋白過表達(dá)，過表達(dá)miR-192通過靶向下調(diào)TCF7抑制骨肉瘤細(xì)胞的惡性行為。本研究檢測(cè)了唑來(lái)膦酸處理的HOS細(xì)胞中TCF7的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，唑來(lái)膦酸可抑制TCF7的表達(dá)；深入研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-520a-3p可逆轉(zhuǎn)唑來(lái)膦酸在HOS細(xì)胞中對(duì)TCF7表達(dá)的抑制作用，敲減TCF7逆轉(zhuǎn)了抑制miR-520a-3p對(duì)唑來(lái)膦酸的骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

綜上所述，唑來(lái)膦酸可能通過調(diào)控miR-520a-3p/TCF7軸抑制骨肉瘤HOS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為骨肉瘤治療提供理論基礎(chǔ)。