張蕾,林瑩波,喬娟,王云璐
作者單位:1河南中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院,河南鄭州450046;2廣東茂名健康職業(yè)學(xué)院,廣東茂名525000
血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤,通常發(fā)生在嬰兒出生時(shí)或出生后兩周,約75%~80%的血管瘤病人為女性。雖然血管瘤是一種良性腫瘤,但嚴(yán)重的血管瘤會(huì)影響皮膚的功能,給病人及其近親屬帶來(lái)沉重的身心負(fù)擔(dān),部分血管瘤的快速生長(zhǎng)和侵襲甚至威脅兒童的生命。因此,了解血管瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于血管瘤的早期診斷和有效的聯(lián)合治療具有至關(guān)重要的作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、擴(kuò)散轉(zhuǎn)移以及血管生成有關(guān)的非編碼RNA。劉筱雯通過(guò)轉(zhuǎn)錄組芯片技術(shù)進(jìn)行嬰幼兒血管瘤組織lncRNAs表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),lncRNA母系表達(dá)基因8(maternally expressed gene 8,MEG8)在血管瘤中表達(dá)上調(diào),且通過(guò)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)驗(yàn)證表達(dá)存在明顯差異。此外,有研究報(bào)道MEG8在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞和胰腺癌Panc1細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),參與肺癌、胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表觀遺傳學(xué)進(jìn)程。但目前MEG8在血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。因此,本研究分析了MEG8在血管瘤組織中的表達(dá),研究MEG8對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制,以期為MEG8作為血管瘤的診療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
血管瘤組織(52例,均為增殖期腫瘤組織)和與其對(duì)應(yīng)的瘤旁正常皮膚組織(52例)由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院于2017年1月至2018年6月間收集。52例樣本來(lái)源于嬰幼兒,其中男性15例,女性37例,年齡為3個(gè)月至12歲之間。在開展本研究之前所有病人近親屬均簽署知情同意書,本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞HemEC細(xì)胞購(gòu)于上??吕咨锟萍加邢薰荆籈BM-2培養(yǎng)基購(gòu)于Lonza公司;胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司;Lipofectamine2000購(gòu)于Invitrogen公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司;Trizol試劑和蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)相關(guān)試劑購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;PCR引物、si-MEG8、si-NC、微小RNA(miR)-497-5p mimics、miR-NC、anti-miR-497-5p、anti-miR-NC、pcDNA3.1、pcDNA3.1-MEG8以 及WTMEG8、MUT-MEG8的構(gòu)建和測(cè)序均由北京華大基因公司提供;兔源細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)單克隆抗體、兔源P21單克隆抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)單克隆抗體、兔源Bcl相關(guān)X(Bax)蛋白多克隆抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體以及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗均購(gòu)于Abcam公司。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組
用含有10%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)HemEC細(xì)胞。培養(yǎng)箱環(huán)境條件是37℃,二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%,濕度90%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HemEC細(xì)胞,按照每孔2×10個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板,利用Lipofectamine2000分別將si-MEG8、si-NC、miR-497-5p mimics、miR-NC轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)融合度為80%的HemEC細(xì)胞,并依次標(biāo)記為si-MEG8組、si-NC組、miR-497-5p組、miR-NC組,培養(yǎng)24~72 h后,檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為驗(yàn)證MEG8能夠通過(guò)調(diào)控miR-497-5p表達(dá),將antimiR-497-5p、anti-miR-NC分別和si-MEG8共轉(zhuǎn)染至HemEC細(xì)胞,并依次標(biāo)記為anti-miR-497-5p組、anti-miR-NC組,培養(yǎng)24-72 h后,檢測(cè)HemEC細(xì)胞的增殖和凋亡情況。1.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)檢測(cè)MEG8和miR
-497
-5p的表達(dá)水平
利用Trizol法分別提取52例血管瘤組織和與其對(duì)相應(yīng)的瘤旁正常皮膚組織,以及各組HemEC細(xì)胞的總RNA,紫外分光光度法測(cè)定其濃度后,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA),隨后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。2法計(jì)算MEG8和miR-497-5p的相對(duì)表達(dá)水平。1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證MEG8和miR
-497
-5p的靶向關(guān)系
利用生物信息軟件預(yù)測(cè)MEG8的靶基因。發(fā)現(xiàn)MEG8與miR-497-5p能夠特異性結(jié)合,猜測(cè)MEG8和miR-497-5p存在靶向調(diào)控關(guān)系,并利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。利用Lipofectamine2000將miR-497-5p mimics和miR-NC分別與WT-MEG8和MUT-MEG8共轉(zhuǎn)染HemEC細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,測(cè)定各組HemEC細(xì)胞的熒光素酶活性。1.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞活力
將對(duì)數(shù)期HemEC細(xì)胞按照2×10個(gè)/孔的密度接種于96孔板,按照“1.2”方法轉(zhuǎn)染后,分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)加入10 μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/L的MTT試劑,孵育4 h后,棄去上清液,各孔再加入二甲基亞砜試劑150 μL,震蕩10 min至結(jié)晶充分溶解,用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度。1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
收集各組對(duì)數(shù)期HemEC細(xì)胞,用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞,離心棄上清液后,用適量的1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×10/mL。每管內(nèi)加入100 μL細(xì)胞懸液,再向管中加入5 μL的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC),室溫避光輕輕地混勻10 min,加入5 μL的碘化丙啶(PI),室溫,避光孵育5 min,加入PBS至500 μL,輕輕混勻,在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)
利用RIPA裂解液裂解各組對(duì)數(shù)期HemEC細(xì)胞,獲得細(xì)胞總蛋白,用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取30 μg已變性的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE),電泳結(jié)束后,利用轉(zhuǎn)膜裝置將已分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用Western封閉液室溫?fù)u床封閉30 min,吸盡封閉液后,用Western洗滌液漂洗膜(共3次,10分鐘/次),然后加入已稀釋的抗cyclin D1(1∶500)、P21(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶500)和GAPDH(1∶2 500)蛋白的Ⅰ抗,室溫孵育2 h后,向已洗滌后的PVDF膜中加入稀釋好的Ⅱ抗,孵育1 h,ECL發(fā)光試劑盒顯色后進(jìn)行拍照,并用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行定量分析。2.1 MEG8和miR
-497
-5p在血管瘤組織和瘤旁正常皮膚組織中的表達(dá)
qRT-PCR檢測(cè)顯示,與瘤旁正常皮膚組織相比,血管瘤組織中MEG8的表達(dá)水平顯著升高[(0.33±0.03)比(0.82±0.08),t
=41.356,P
<0.001],miR-497-5p的表達(dá)水平顯著降低[(0.84±0.08)比(0.34±0.03),t
=42.200,P
<0.001]。2.2 抑制MEG8對(duì)細(xì)胞HemEC增殖的影響
如表1和圖1所示,與si-NC組比較,si-MEG8組HemEC細(xì)胞MEG8的表達(dá)水平降低(P
<0.05),表明成功構(gòu)建抑制MEG8表達(dá)的HemEC細(xì)胞株。與si-NC組比較,si-MEG8組HemEC細(xì)胞cyclin D1蛋白的表達(dá)水平降低,P21蛋白的表達(dá)水平升高;細(xì)胞在24 h、48 h和72 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率降低(P
<0.05)。表明,抑制MEG8能夠抑制血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。表1 抑制母系表達(dá)基因8(MEG8)對(duì)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞HemEC增殖的影響/±s
圖1 抑制母系表達(dá)基因8(MEG8)對(duì)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞HemEC增殖蛋白表達(dá)的影響
2.3 抑制MEG8對(duì)細(xì)胞HemEC凋亡的影響
如表2所示,與si-NC組相比,si-MEG8組HemEC細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平降低,Bax蛋白表達(dá)水平升高,細(xì)胞凋亡率增加(P
<0.05)。表明,抑制MEG8能夠促進(jìn)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。表2 抑制母系表達(dá)基因8(MEG8)對(duì)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞HemEC凋亡的影響/±s
2.4 MEG8靶向調(diào)控miR
-497
-5p表達(dá)
利用生物學(xué)信息軟件在線進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)顯示,見圖2,miR-497-5p和MEG8存在部分連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)。與miRNC和WT-MEG8共轉(zhuǎn)染組相比,miR-497-5p和WTMEG8共轉(zhuǎn)染組HemEC細(xì)胞的熒光素酶活性降低[(0.37±0.04)比(1.05±0.10),t
=15.465,P
<0.001];與miR-NC和MUT-MEG8共轉(zhuǎn) 染組 相比,miR-497-5p和WT-MEG8共轉(zhuǎn)染組HemEC細(xì)胞的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.07±0.10)比(1.08±0.10),t
=0.173,P
=0.866]。pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MEG8組、si-NC組、si-MEG8組四組比較,F
=195.212,P
<0.001。pcDNA3.1-MEG8組HemEC細(xì)胞miR-497-5p表達(dá)水平低于pcDNA3.1組[(0.09±0.01)比(0.38±0.05),P
<0.05];si-MEG8組HemEC細(xì)胞miR-497-5p表達(dá)水平高于si-NC組[(0.88±0.09)比(0.39±0.05),P
<0.05]。以上結(jié)果表明,miR-497-5p是MEG8的靶基因,MEG8可負(fù)性調(diào)控miR-497-5p的表達(dá)。圖2 生物學(xué)信息軟件在線預(yù)測(cè)母系表達(dá)基因8(MEG8)與miR-497-5p結(jié)合位點(diǎn)
2.5 過(guò)表達(dá)miR
-497
-5p對(duì)細(xì)胞HemEC增殖、凋亡的影響
如表3,4所示,與miR-NC組比較,miR-497-5p組HemEC細(xì)胞miR-497-5p的表達(dá)水平上調(diào)(P
<0.05),表明已成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-497-5p的HemEC細(xì)胞株。與miR-NC組比較,miR-497-5p組HemEC細(xì)胞cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平降低,P21和Bax蛋白的表達(dá)水平升高(P
<0.05);細(xì)胞在24 h、48 h和72 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率降低,細(xì)胞凋亡率增加(P
<0.05)。表明,過(guò)表達(dá)miR-497-5p能夠抑制血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。表3 過(guò)表達(dá)miR-497-5p對(duì)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞HemEC增殖的影響/±s
表4 過(guò)表達(dá)miR-497-5p對(duì)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞HemEC凋亡的影響/±s
2.6抑制miR
-497
-5p能逆轉(zhuǎn)抑制MEG8對(duì)細(xì)胞HemEC增殖、凋亡的作用
如表5,6所示,與si-NC組相比,si-MEG8組HemEC細(xì)胞miR-497-5p、cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平降低,P21和Bax蛋白的表達(dá)水平升高,在24 h、48 h和72 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率降低,細(xì)胞凋亡率增加(P
<0.05);與si-MEG8+anti-miR-NC組 相 比,si-MEG8+anti-miR-497-5p組HemEC細(xì)胞miR-497-5p、cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平升高,P21和Bax蛋白的表達(dá)水平降低,在24 h、48 h和72 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率增加,細(xì)胞凋亡率下降(P
<0.05)。以上結(jié)果表明,抑制miR-497-5p表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)抑制MEG8對(duì)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。表5 抑制miR-497-5p能逆轉(zhuǎn)抑制母系表達(dá)基因8(MEG8)對(duì)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞HemEC增殖的影響/±s
近年來(lái),lncRNA在血管瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。馬從乾等研究發(fā)現(xiàn),LINC00152在血管瘤組織中的表達(dá)明顯上調(diào),LINC00152可通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)表達(dá)促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲;Zhao等研究表明,核內(nèi)小RNA宿主基因16(SNHG16)在血管瘤組織中呈高表達(dá),SNHG16通過(guò)調(diào)控miR-520d-3p/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)軸,作為細(xì)胞增殖、血管形成、遷移和侵襲的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA;Zhang等報(bào)道沉默尿路上皮癌相關(guān)1(UCA1)通過(guò)上調(diào)miR-200c表達(dá)抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞存活,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制血管瘤生長(zhǎng);此外,腫瘤易感性候選基因9(CASC9)和opa相互作用蛋白5反義轉(zhuǎn)錄本1(OIP5-AS1)也參與對(duì)血管瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。以上研究提示,lncRNA在血管瘤的進(jìn)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,探索與血管瘤相關(guān)的lncRNA,對(duì)血管瘤病人的精準(zhǔn)治療具有重大意義。
MEG8基因定位于人14號(hào)染色體和鼠12號(hào)染色體,是最早在小鼠中鑒定的印記基因。其與父系表達(dá)基因Dlk1和Dio3以及若干母系表達(dá)基因Gtl2、Meg3、Mirg等構(gòu)成Dlk1-Dio3印記區(qū)域,參與調(diào)控肌肉形成和胚胎發(fā)育。目前,關(guān)于MEG8基因在腫瘤的研究還比較少,僅發(fā)現(xiàn)MEG8在TGF-β誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞和胰腺癌Panc1細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),MEG8通過(guò)與EZH2蛋白增強(qiáng)子結(jié)合,誘導(dǎo)其募集到miR-34a和miR-203的調(diào)節(jié)區(qū)域,促進(jìn)H3甲基化,抑制轉(zhuǎn)錄。然而,其人類同系物Meg3基因在腫瘤中的作用被廣泛報(bào)道。例如,在宮頸癌中,Meg3表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)Meg3通過(guò)靶向miR-21-5p可抑制宮頸癌腫瘤的生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;在胃癌中,Meg3也呈低表達(dá),過(guò)表達(dá)Meg3通過(guò)調(diào)控p53信號(hào)通路可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移;此外,Meg3還可發(fā)揮內(nèi)源性miR-494分子海綿作用調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路抑制血管瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn),MEG8在血管瘤組織中表達(dá)上調(diào),抑制MEG8能夠抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。表明,MEG8在血管瘤中發(fā)揮癌基因作用。
表6 抑制miR-497-5p能逆轉(zhuǎn)抑制母系表達(dá)基因8(MEG8)對(duì)血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞HemEC凋亡的影響/±s
為探索MEG8調(diào)控血管瘤發(fā)生的分子機(jī)制,利用生物信息學(xué)軟件在線進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-497-5p是MEG8的潛在靶基因。miR-497-5p是一種抑癌基因,研究發(fā)現(xiàn),miR-497-5p在非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)miR-497-5p能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示,miR-497-5p在血管瘤組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)。同時(shí)通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)證實(shí)MEG8可靶向負(fù)性調(diào)控miR-497-5p表達(dá),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-497-5p能夠抑制cyclin D1和Bcl-2蛋白表達(dá),促進(jìn)P21和Bax蛋白表達(dá),抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步證實(shí)MEG8通過(guò)調(diào)控miR-497-5p表達(dá)參與對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控,將si-MEG8和anti-miR-497-5p共轉(zhuǎn)染至血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)抑制miR-497-5p表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)抑制MEG8對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。提示MEG8通過(guò)靶向調(diào)控miR-497-5p表達(dá)促進(jìn)血管瘤的發(fā)生發(fā)展。
綜上所述,lncRNA MEG8在血管瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào),miR-497-5p表達(dá)下調(diào),抑制MEG8通過(guò)靶向miR-497-5p能夠抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,MEG8有望成為血管瘤分子治療的新靶點(diǎn)。