文若劍 陳曉青 田香

(江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1生理教研室，湖北 武漢 430056；2藥理教研室；3武漢生物醫(yī)學(xué)研究院)

癲癇主要表現(xiàn)為大腦內(nèi)神經(jīng)元的異常興奮導(dǎo)致的反復(fù)、突然抽搐。癲癇是常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，與多種神經(jīng)認(rèn)知障礙相關(guān)，聯(lián)合發(fā)病會(huì)大大提高致死率〔1，2〕。長(zhǎng)期、頻繁的癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)可導(dǎo)致急性和持久的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及海馬神經(jīng)元損傷，從而導(dǎo)致持久性的認(rèn)知功能障礙〔3〕。關(guān)于癲癇中伴隨著認(rèn)知功能障礙的主要原因集中在神經(jīng)元樹(shù)突棘丟失上，而癲癇中Wnt/β-catenin通路異常可能是導(dǎo)致該損傷的主要原因，同時(shí)Wnt/β-catenin通路也是對(duì)急性和慢性癲癇都能有效治療的分子靶點(diǎn)。顳葉癲癇發(fā)病率占所有癲癇的25%，臨床上針對(duì)該種癲癇類型病人的多種抗癲癇藥物的療效并不理想〔4，5〕。因此，控制和減少SE后神經(jīng)元損傷及抑制難治性癲癇的發(fā)生具有重要臨床意義。研究表明，F(xiàn)ox轉(zhuǎn)錄因子家族的一員又頭框G1基因(FoxG1)的功能異常會(huì)引起一系列大腦發(fā)育疾病障礙，以嚴(yán)重的智力障礙、語(yǔ)言能力缺失、自閉癥行為、運(yùn)動(dòng)功能異常及癲癇為特征〔6〕。而且有研究證明在肝癌細(xì)胞中FoxG1會(huì)通過(guò)Wnt/β-catenin通路促進(jìn)上皮細(xì)胞間質(zhì)化〔7〕。那么癲癇后的認(rèn)知功能障礙很有可能是由于FoxG1介導(dǎo)的Wnt/β-catenin通路異常，可以通過(guò)干預(yù)FoxG1來(lái)改善癲癇后的認(rèn)知功能障礙。微小RNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控〔8〕。因此，通過(guò)miRNA來(lái)調(diào)控目的基因的表達(dá)從而影響疾病的病理進(jìn)程是一個(gè)有效的手段。有研究表明，miR-9可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)控制前體細(xì)胞的增殖與分化〔9〕，核受體蛋白(Nr2e1)、抑制元素1-沉默轉(zhuǎn)錄因子(REST)、REST輔助抑制因子(CoREST)、肌動(dòng)蛋白樣蛋白6A抗體(BAF53a)與FoxG1均為miR-9的調(diào)控底物〔10～12〕。那么通過(guò)miR-9對(duì)于FoxG1的調(diào)控來(lái)改善癲癇中Wnt/β-catenin通路異常導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，可能是一個(gè)潛在的有效治療方式。本研究旨在探討該途徑在顳葉癲癇后學(xué)習(xí)記憶功能障礙的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癲癇造模及評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物飼養(yǎng)：C57BL/6小鼠(3月齡)66只，體重24～26 g，飼養(yǎng)于23℃±2℃，12 h晝夜燈光交替獨(dú)立通風(fēng)籠具系統(tǒng)(IVC)動(dòng)物房，高壓滅菌水食，自由進(jìn)食飲水。

18只實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=3)和實(shí)驗(yàn)組(n=15)，實(shí)驗(yàn)組又分為1、7、14、30、60 d 5組，每組3只小鼠。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行模型制備：以20 mg/kg的劑量腹腔注射海人藻酸，注射后連續(xù)觀察5 h小鼠的行為。當(dāng)小鼠癲癇持續(xù)發(fā)作抽搐達(dá)1 h，以4 mg/kg的劑量腹腔注射地西泮終止癲癇發(fā)作。若未能緩解癲癇發(fā)作，可重復(fù)適量腹腔注射地西泮1～2次，直到癲癇發(fā)作終止。對(duì)照組同樣腹腔注射的方式給予生理鹽水(35 μl/g)以取代海人藻酸，其余的用藥、步驟及方法同海人藻酸組一致。癲癇性發(fā)作按Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定：0級(jí)，無(wú)抽搐發(fā)作；Ⅰ級(jí)，耳、面部抽搐；Ⅱ級(jí)，肌陣攣，但無(wú)直立位；Ⅲ級(jí)，肌陣攣，伴直立位；Ⅳ級(jí)，全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作；Ⅴ級(jí)，強(qiáng)直陣攣發(fā)作，并失去體位控制。以出現(xiàn)持續(xù)1 h的Ⅲ級(jí)以上的發(fā)作，并在解除癇性發(fā)作后狀態(tài)良好的小鼠為癲癇持續(xù)狀態(tài)模型成功鼠。

1.2RNA提取與熒光實(shí)時(shí)定量PCR 癲癇造模后取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)(1 d、7 d、14 d、30 d、60 d)小鼠海馬組織提取RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)FoxG1、Wnt3和β-catenin的表達(dá)情況。取小鼠的大腦海馬組織，液氮快速研磨后，采用Trizol(Invitrogen)法提取總RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)量所提RNA的濃度與純度。使用FSQ-401 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remove試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用于FoxG1、Wnt3、β-catenin的檢測(cè)。按照說(shuō)明使用Roche的PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增，采用ΔΔCT 法分析。GAPDH為FoxG1、Wnt3、β-catenin的內(nèi)參。FoxG1正向引物：5′-TGGCCCATGTCGCCCTTCCT-3′；FoxG1反向引物：5′-GCCGACGTGGTGCCGTTGTA-3′；Wnt3正向引物：5′-CTGCCAGGAGTGTATTCGCATC-3′；Wnt3反向引物：5′-GAGAGCCTCCCCGTCCACAG-3′；β-catenin正向引物：5′-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA-3′；β-catenin反向引物：5′-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3′；GAPDH正向引物：5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′；GAPDH反向引物：5′-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3′。

1.3立體定位注射 48只小鼠隨機(jī)分配到Con組(n=16)、EGFP組(n=16)、miR-9 Sponge組(n=16),經(jīng)腦立體定位注射后每組各取8只進(jìn)行水迷宮檢測(cè)，各組剩余小鼠進(jìn)行條件性恐懼實(shí)驗(yàn)。將6%水合氯醛以6 ml/kg的劑量緩慢腹腔注射，麻醉小鼠并隨時(shí)注意小鼠的呼吸狀態(tài)等。將小鼠的門齒固定于腦定位儀上頜固定器，然后調(diào)整兩側(cè)耳棒對(duì)準(zhǔn)動(dòng)物的外道，使動(dòng)物的頭在處于兩滑道正中，保持兩個(gè)耳棒的刻度一致，然后將兩耳棒上的固定螺絲扭緊，再將牙齒固定器上壓鼻環(huán)壓下后扭緊，保證從不同方向推壓動(dòng)物頭部均不會(huì)出現(xiàn)移動(dòng)。接下來(lái)剪去動(dòng)物頭部毛，用2%碘酒及75%酒精棉球作頭部皮膚的消毒，沿矢狀縫作一約0.8 cm長(zhǎng)的皮膚切口，分離皮下組織，使用棉簽擦拭，推開(kāi)骨膜，暴露前囟、人字縫及矢狀縫。然后將腦袋定位達(dá)到平衡狀態(tài)。用定位針在前囟后2.1 mm，矢狀縫旁開(kāi)1.3 mm處定位一點(diǎn)，即為海馬的平面位置，然后在此點(diǎn)上用鉆孔針在顱骨上鉆一小圓孔。小鼠海馬DG則位于該圓孔下2 mm。使用微量注射器吸入實(shí)驗(yàn)組病毒AAV-CamkII-miR-9-sponge-EGFP或者對(duì)照病毒AAV-CamkII-EGFP(Genechem)后，安置到微量注射泵上，使注射器針頭由小鼠腦鉆孔處下降2 mm時(shí)，開(kāi)始病毒注射。以50 nl/min的速度注射2 μl，隨后待注射停止后原位置留針5 min，然后上移1 mm，繼續(xù)留針5 min。拔針后使用2% 碘酒及75% 酒精棉球給頭部皮膚消毒，然后縫皮。

1.4行為學(xué)檢測(cè) 水迷宮檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將實(shí)驗(yàn)小鼠放入水迷宮房間適應(yīng)環(huán)境3 h。實(shí)驗(yàn)所采用的檢測(cè)系統(tǒng)為高60 cm，直徑長(zhǎng)120 cm的圓柱形水池；高40 cm，直徑長(zhǎng)10 cm的圓柱形有機(jī)玻璃平臺(tái)；水池上空安裝有攝像機(jī)并與計(jì)算機(jī)相連記錄小鼠在水迷宮中的活動(dòng)。在水池內(nèi)放水至高出平臺(tái)表面約0.5 cm，室溫及水溫均保持在(25±2)℃。在水中加入鈦白粉以便于記錄小鼠(黑鼠)的運(yùn)動(dòng)軌跡。在水池四周設(shè)置固定圖形以便于小鼠識(shí)別方位。設(shè)置實(shí)驗(yàn)總時(shí)長(zhǎng)90 s，記錄小鼠每次從入水點(diǎn)至到達(dá)平臺(tái)所需時(shí)間(潛伏期)及在該潛伏期內(nèi)的運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)軌跡。訓(xùn)練時(shí)使小鼠頭向水池壁從固定點(diǎn)(任一象限1/2弧度處)沿筒壁輕輕放入水中，從小鼠入水時(shí)刻立即開(kāi)始記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，至小鼠找到隱蔽平臺(tái)為時(shí)間終點(diǎn)，記為潛伏期。設(shè)置定位航行實(shí)驗(yàn)總時(shí)長(zhǎng)為90 s，若小鼠未在該時(shí)間段內(nèi)找到平臺(tái)，則計(jì)算機(jī)系統(tǒng)停止追蹤記錄，并記錄潛伏期為90 s。沒(méi)有找到平臺(tái)的小鼠將被人為引導(dǎo)至平臺(tái)，停留20 s。每只小鼠每天在3個(gè)象限分別訓(xùn)練1次，共3次，每次訓(xùn)練結(jié)束后休息30 min，連續(xù)訓(xùn)練7 d。每天保持隔音實(shí)驗(yàn)房間內(nèi)的環(huán)境條件不變。

場(chǎng)景依賴條件性恐懼記憶檢測(cè)：整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期共有3天。第1天為訓(xùn)練階段，實(shí)驗(yàn)前先用一只非實(shí)驗(yàn)小鼠測(cè)試電流刺激強(qiáng)度。測(cè)試正常后，將實(shí)驗(yàn)小鼠置于條件恐懼通電柵欄底板實(shí)驗(yàn)箱中開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)適應(yīng)期為4 min，使小鼠在方形箱內(nèi)自由活動(dòng)，同時(shí)記錄小鼠的基礎(chǔ)水平僵直的百分比。適應(yīng)期結(jié)束后立即給予小鼠一個(gè)長(zhǎng)達(dá)2 s，強(qiáng)度為1 mA的足底電刺激，隨后進(jìn)入58 s的休息段。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均需用70%乙醇擦拭箱內(nèi)各壁，氣味散盡后檢測(cè)下一只。第2天是檢測(cè)情景關(guān)聯(lián)(Context)的恐懼記憶，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后將小鼠放入與第1天相同的試驗(yàn)箱中自由活動(dòng)5 min，記錄小鼠的僵直百分比。然后變更場(chǎng)景(Altered content)測(cè)試，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將場(chǎng)景更換為四周貼滿黑白條紋紙、箱底部為平滑模板的新方箱(Content B)，實(shí)驗(yàn)中將小鼠置于新實(shí)驗(yàn)箱中自由活動(dòng)5 min，記錄小鼠的僵直百分比。測(cè)試系統(tǒng)對(duì)僵直行為進(jìn)行評(píng)分來(lái)測(cè)量該階段的恐懼記憶。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graphpad 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析作圖，多組之間采用單因素方差分析組間差異，兩組之間采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1FoxG1與Wnt/β-catenin通路在癲癇后時(shí)間序列表達(dá)呈正相關(guān) 造模不同時(shí)間β-catenin相對(duì)表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢(shì)，Wnt3的相對(duì)表達(dá)水平也下調(diào)；而且顳葉癲癇后FoxG1的表達(dá)與Wnt/β-catenin通路相一致，并且均在癲癇發(fā)作后第14天達(dá)到最低峰，且FoxG1的表達(dá)下調(diào)是持續(xù)的，先于Wnt/β-catenin通路異常，結(jié)果表明，F(xiàn)oxG1與Wnt/β-catenin通路的表達(dá)在顳葉癲癇中呈正相關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 造模不同時(shí)間小鼠β-catenin、Wnt3、FoxG1表達(dá)比較

2.2抑制miR-9通過(guò)上調(diào)FoxG1改善癲癇中Wnt/β-catenin通路異常 miR-9-Sponge組FoxG1、Wnt、β-catenin水平均顯著高于EGFP組(P<0.05)。見(jiàn)表2。表明miR-9在小鼠DG抑制之后，通過(guò)上調(diào)FoxG1的表達(dá)來(lái)改善顳葉癲癇中Wnt/β-catenin通路表達(dá)異常。

表2 EGFP組和miR-9 Sponge組β-catenin、Wnt3、FoxG1表達(dá)比較

2.3抑制miR-9改善癲癇后小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙 miR-9 Sponge組相對(duì)于EGFP組的空間學(xué)習(xí)能力明顯提升，恢復(fù)至于Con組同等水平；相較于EGFP組，miR-9 Sponge組小鼠的空間記憶能力也明顯提升恢復(fù)至正常水平；恐懼記憶檢測(cè)中，EGFP組在癲癇造模后也表現(xiàn)出明顯的記憶障礙，在小鼠海馬齒狀回抑制miR-9之后有顯著的改善。見(jiàn)表3、表4。

表4 各組恐懼記憶能力、空間記憶能力比較

3 討 論

FoxG1是一個(gè)具有廣泛生物學(xué)影響的轉(zhuǎn)錄抑制因子，可調(diào)節(jié)大腦腹側(cè)-背側(cè)的模式〔13〕，在Cajal-Retzius細(xì)胞中非常重要，可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增生和促進(jìn)神經(jīng)新生〔14〕。前腦FoxG1的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)上皮細(xì)胞增厚，這可能是導(dǎo)致神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡的主要原因〔15〕。但是FoxG1表達(dá)異常導(dǎo)致癲癇的原因尚不清楚。Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能是癲癇疾病中急性和慢性期均適用的一個(gè)潛在的治療靶標(biāo)〔16〕。Wnt/β-catenin通路可參與調(diào)節(jié)許多癲癇導(dǎo)致的大腦的變化，包括神經(jīng)新生、神經(jīng)細(xì)胞死亡，同時(shí)也可以影響癲癇的發(fā)作及癲癇慢性期的發(fā)展。有研究證明癲癇與Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常密切相關(guān)〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制miR-9后明顯改善了顳葉癲癇后小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙及場(chǎng)景依賴性的恐懼記憶缺陷。綜上所述，抑制miR-9可通過(guò)上調(diào)FoxG1的表達(dá)來(lái)改善癲癇中Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常，從而改善顳葉癲癇后小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，為顳葉癲癇的臨床控制與治療提供了新的思路與靶標(biāo)。