周斌鋒 彭兵鋒 王志強(qiáng) 喻國平 張小強(qiáng)

(1鷹潭市人民醫(yī)院心胸外科，江西 鷹潭 335000；2南昌大學(xué)附屬第二醫(yī)院胸外科)

肺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，據(jù)調(diào)查研究顯示全世界范圍內(nèi)肺癌發(fā)病率持續(xù)升高，其中非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要病理類型，目前臨床常采用手術(shù)、化療等手段治療肺癌，但肺癌患者生存率仍未明顯升高〔1〕。近年來，免疫治療與分子靶向治療成為研究熱點(diǎn)，因而深入探究肺癌發(fā)生的分子生物過程有助于尋找新的治療靶點(diǎn)以此提高患者生存率。長鏈非編碼RNA(LncRNA)TMPO-AS1可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔2，3〕。但TMPO-AS1在肺癌發(fā)生及發(fā)展過程中的分子機(jī)制尚未完全闡明。LncBase v.2網(wǎng)站預(yù)測顯示微小RNA-143-3p(miR-143-3p)可能是TMPO-AS1的靶基因，研究表明miR-143-3p在結(jié)腸癌、宮頸癌、喉部鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中均呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移〔4～8〕。但TMPO-AS1是否可通過靶向miR-143-3p促進(jìn)肺癌發(fā)生及發(fā)展尚未可知。因此，本研究主要探討TMPO-AS1與miR-143-3p在肺癌細(xì)胞中的相互作用關(guān)系，初步分析其對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響，為肺癌靶向治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 BEAS-2B、肺癌細(xì)胞A549、SPC-A-1、H446、PC-9均購自美國ATCC細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；TMPO-AS1小干擾RNA(si-TMPO-AS1)、si-con、miR-143-3p mimics、miR-con、miR-143-3p抑制劑(anti-miR-143-3p)、anti-miR-con均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；pcDNA3.1購自北京合生基因科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；MTT細(xì)胞增殖試劑盒購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；兔抗人PCNA、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗人酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 BEAS-2B細(xì)胞與肺癌細(xì)胞A549、SPC-A-1、H446、PC-9均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，接種于6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至50%時(shí)，參照Lipofectamine2000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)將肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞隨機(jī)分為si-con組(si-con分別轉(zhuǎn)染入SPC-A-1、H446細(xì)胞)、si-TMPO-AS1組(si-TMPO-AS1分別轉(zhuǎn)染入SPC-A-1、H446細(xì)胞)、miR-con組(miR-con分別轉(zhuǎn)染入SPC-A-1、H446細(xì)胞)、miR-143-3p組(miR-143-3p mimics分別轉(zhuǎn)染入SPC-A-1、H446細(xì)胞)、si-TMPO-AS1 +anti-miR-con組(si-TMPO-AS1與anti-miR-con分別共轉(zhuǎn)染入SPC-A-1、H446細(xì)胞)、si-TMPO-AS1 +anti-miR-143-3p組(si-TMPO-AS1 與anti-miR-143-3p分別共轉(zhuǎn)染入SPC-A-1、H446細(xì)胞)，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)功能驗(yàn)證。

1.2.2qRT-PCR檢測細(xì)胞中TMPO-AS1、miR-143-3p表達(dá)水平 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測RNA濃度，取2μg RNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR檢測TMPO-AS1、miR-143-3p的表達(dá)水平，反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃ 2 min(循環(huán)1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循環(huán)40次)，檢測miR-143-3p表達(dá)時(shí)以U6為內(nèi)參，TMPO-AS1以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TMPO-AS1、miR-143-3p相對表達(dá)量。

1.2.3噻唑藍(lán)(MTT)檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后各組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞按照每孔5 ×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，同時(shí)設(shè)置空白孔(培養(yǎng)液、無細(xì)胞)，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩，充分混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=〔(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值)/(正常培養(yǎng)組OD值-空白對照OD值)〕×100%。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集各組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，4℃，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min(離心半徑12 cm)，棄上清，加入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)5 ml，洗滌細(xì)胞沉淀，相同條件下再次離心，反復(fù)洗滌3次，加入培養(yǎng)基，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×103個(gè)/ml，單細(xì)胞懸液接種于6孔板進(jìn)行克隆形成培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)14 d后觀察細(xì)胞克隆形成情況，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 分別收集各組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，4℃，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，加入預(yù)冷PBS洗滌2次，每次5 min，棄上清，渦旋振蕩30 s，制備細(xì)胞懸浮液，加入200 μl結(jié)合緩沖液，再加入10 μl Annexin V-FITC。振蕩混勻，冰上避光孵育30 min，加入5 μl PI，渦旋振蕩混勻，冰上孵育5 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，渦旋振蕩混勻，使用300目尼龍網(wǎng)過濾，于1 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移及侵襲 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞培養(yǎng)于含有0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取2×105個(gè)細(xì)胞接種于含有基質(zhì)膠的Transwell小室上室中(直徑6.5 μm，孔徑8 μm)，取500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于Transwell小室的下腔中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱機(jī)修培養(yǎng)24 h，去除上膜表面上的細(xì)胞，用多聚甲醛固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染色液染色10 min，無菌水清洗后置于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取2×105個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室上室中，其余實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 構(gòu)建TMPO-AS1攜帶的3′UTR的熒光素酶報(bào)告因子，每個(gè)基因的結(jié)合位點(diǎn)與miR-143-3p結(jié)合位點(diǎn)相對應(yīng)，熒光素酶測定顯示TMPO-AS1與miR-143-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，將結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)分別載入熒光素酶報(bào)告基因載體，分別為野生型WT-TMPO-AS1、突變型MUT-TMPO-AS1，WT-TMPO-AS1、MUT-TMPO-AS1分別與miR-143-3p mimics、miR-con分別共轉(zhuǎn)染入肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因測定系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8Western印跡檢測PCNA、MMP-2、酶切caspase-3蛋白表達(dá) 分別取各組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min(離心半徑6 cm)提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白煮沸變性，取變性完成蛋白樣品30 μg/孔加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的加樣孔內(nèi)，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃輕搖24 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，避光加入ECL顯色液，曝光，顯影，凝膠分析系統(tǒng)及ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TMPO-AS1和 miR-143-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá) 與BEAS-2B相比，肺癌細(xì)胞A549、SPC-A-1、H446、PC-9中TMPO-AS1的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而肺癌細(xì)胞A549、SPC-A-1、H446、PC-9中 miR-143-3p的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見表1。其中肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞中TMPO-AS1的表達(dá)水平相比于其他肺癌細(xì)胞系明顯升高(均P<0.05)，因而本研究選取肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 檢測肺癌細(xì)胞中TMPO-AS1和 miR-143-3p表達(dá)

2.2沉默TMPO-AS1或過表達(dá) miR-143-3p對肺癌細(xì)胞增殖的影響 與si-con組相比，si-TMPO-AS1組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞存活率及克隆形成率顯著降低(P<0.05)，PCNA蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；相較于miR-con組，miR-143-3p組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞存活率、克隆形成率與PCNA蛋白的表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 檢測肺癌細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)

2.3沉默TMPO-AS1或過表達(dá) miR-143-3p對肺癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，si-TMPO-AS1組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞凋亡率均顯著高于si-con組(均P<0.05)，酶切caspase-3表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05)；相較于miR-con組，miR-143-3p組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增多(均P<0.05)，酶切caspase-3的表達(dá)均上調(diào)(均P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和Western印跡檢測肺癌細(xì)胞中酶切caspase-3蛋白表達(dá)

2.4沉默TMPO-AS1或過表達(dá) miR-143-3p對肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞中沉默TMPO-AS1或 miR-143-3p過表達(dá)后，與si-con組比較，si-TMPO-AS1組細(xì)胞遷移及侵襲均數(shù)顯著減少(均P<0.05)，MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與miR-con組比較，miR-143-3p組細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)，MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖3、圖4、表4。

圖3 Transwell檢測肺癌細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

圖4 Western印跡檢測各組MMP-2表達(dá)

2.5TMPO-AS1靶向調(diào)控 miR-143-3p的表達(dá) LncBase v.2網(wǎng)站預(yù)測顯示TMPO-AS1與 miR-143-3p存在互補(bǔ)靶向序列，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞中轉(zhuǎn)染克隆有TMPO-AS1-3′UTR突變型載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-143-3p組與miR-con組比較，熒光素酶活性差異無顯著性；轉(zhuǎn)染克隆有TMPO-AS1-3′UTR載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-143-3p組熒光素酶活性明顯受到抑制，與miR-con組比較，熒光素酶活性差異具有顯著性(P<0.05)，見表5。

圖5 TMPO-AS1與 miR-143-3p存在互補(bǔ)靶向序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，si-TMPO-AS1組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞中miR-143-3p的表達(dá)水平顯著高于si-con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，pcDNA-TMPO-AS1組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞中miR-143-3p的表達(dá)水平顯著低于pcDNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6 LncRNA TMPO-AS1調(diào)控 miR-143-3p的表達(dá)

2.6干擾 miR-143-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默TMPO-AS1對肺癌細(xì)胞的抑制作用 相較于si-TMPO-AS1+anti-miR-con組，si-TMPO-AS1+anti-miR-143-3p組肺癌SPC-A-1、H446細(xì)胞存活率與克隆形成率均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PCNA、MMP-2蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而酶切caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6、表7、表8。

1～4：si-con組、si-TMPO-AS1組、si-TMPOAS1+anti-miR-con組、si-TMPOAS1+anti-miR-143-3p組圖6 Western印跡檢測肺癌細(xì)胞中酶切caspase-3、PCNA和MMP-2蛋白表達(dá)

3 討 論

大部分肺癌患者確診時(shí)已處于中晚期，經(jīng)臨床治療后患者預(yù)后較差〔9〕。因而急需尋找早期診斷及監(jiān)測肺癌的新方法。研究表明LncRNA可能通過調(diào)控miRNA而參與肺癌發(fā)生及發(fā)展過程〔10，11〕。但仍有部分LncRNA-miRNA在肺癌發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究深入分析TMPO-AS1與miR-143-3p在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用機(jī)制。

TMPO-AS1在肺腺癌患者血清中呈高表達(dá)，其高表達(dá)量與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，研究表明TMPO-AS1還可能競爭性吸附miRNA而參與肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程〔12，13〕。本研究結(jié)果提示TMPO-AS1表達(dá)水平升高可能促進(jìn)肺癌的發(fā)生，沉默TMPO-AS1表達(dá)可顯著降低肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明PCNA可反映腫瘤細(xì)胞增殖，其表達(dá)水平升高預(yù)示細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，MMP-2過表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力，酶切caspase-3蛋白是細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中的關(guān)鍵因子，其表達(dá)量升高預(yù)示凋亡細(xì)胞數(shù)增加〔14～16〕。本研究結(jié)果提示沉默TMPO-AS1表達(dá)可通過上調(diào)Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及下調(diào)PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

miR-143-3p在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-143-3p過表達(dá)可通過靶向LIM結(jié)構(gòu)域激酶1的表達(dá)而抑制乳腺癌發(fā)生及發(fā)展〔17〕。研究表明miR-142-3p通過靶向CDC25C，TGFβR1，GNAQ，WASL、RAC1抑制黑色素瘤惡性進(jìn)展〔18〕。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果表明miR-143-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低，miR-143-3p過表達(dá)與沉默TMPO-AS1后對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的作用效果相同，同時(shí)本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明TMPO-AS1可靶向負(fù)性調(diào)控miR-143-3p的表達(dá)，提示TMPO-AS1可能靶向抑制miR-143-3p表達(dá)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示沉默TMPO-AS1表達(dá)可通過上調(diào)miR-143-3p表達(dá)而減弱肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，TMPO-AS1可調(diào)控miR-143-3p的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡，為揭示肺癌發(fā)生的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，可為肺癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。