徐成陽(yáng) 段紅艷 李明艷

(河南省人民醫(yī)院暨鄭州大學(xué)人民醫(yī)院國(guó)際醫(yī)療中心一病區(qū)，河南 鄭州 450003)

血糖變化引起的血管內(nèi)皮受損是動(dòng)脈粥樣硬化性病變的原因，而動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病(DM)血管并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，DM血管并發(fā)癥可導(dǎo)致患者致死、致殘〔1，2〕。研究DM血管并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制，針對(duì)發(fā)病機(jī)制為靶點(diǎn)的治療有助于DM慢性并發(fā)癥的防治〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)與血管內(nèi)皮細(xì)胞病理性增殖及脂代謝相關(guān)，在DM及其血管并發(fā)癥中具有重要作用〔4〕。核旁叢組裝轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)是一個(gè)非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)抑制NEAT1通過(guò)靶向miR-204和調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB途徑減輕了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷〔5〕。上調(diào)NEAT1有助于神經(jīng)保護(hù)機(jī)制抵抗神經(jīng)元損傷〔6〕。沉默NEAT1可減弱血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移〔7〕。微小RNA(miRNA)參與調(diào)控DM及相關(guān)疾病〔8〕。miR-217通過(guò)調(diào)控SIRT1參與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔9〕。過(guò)表達(dá)miR-217還可促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞的衰老〔10〕。然而lncRNA NEAT1對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其機(jī)制是否與miR-217有關(guān)還尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA NEAT1對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其機(jī)制是否與miR-217有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EAhy926(上海細(xì)胞庫(kù))；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone)；Trizol試劑、熒光定量試劑盒(美國(guó)Progema)；RIPA蛋白裂解液(上海碧云天)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(北京Solarbio)；載體質(zhì)粒(上海伯易生物)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 EAhy926細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中，用終濃度為25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h作為高糖(HG)組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照(NG)組；將pcDNA、pcDNA-NEAT1、anti-miR-con、anti-miR-217轉(zhuǎn)染至高糖處理的EAhy926細(xì)胞中，計(jì)為HG+pcDNA組、HG+pcDNA-NEAT1組、HG+anti-miR-con組和HG+nti-miR-217組；將pcDNA-NEAT1與miR-con、miR-217分別共同轉(zhuǎn)染至高糖處理的EAhy926細(xì)胞中，記為HG+pcDNA-NEAT1+miR-con組、HG+pcDNA-NEAT1+miR-217組。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)miR-217和NEAT1的表達(dá)水平 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，miR-217和NEAT1分別以U6和β-actin為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3Western印跡檢測(cè)細(xì)胞周期素(Cyclin)D1、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后用5 %脫脂奶粉封閉，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育2 h，顯影、定影，分析蛋白條帶的吸光度，β-actin為參照計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度(OD)值。以NG為對(duì)照計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，漂洗后加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸；然后分別加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻、避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NEAT1對(duì)miR-217的靶向調(diào)控 將NEAT1野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體分別與miR-con和miR-217共轉(zhuǎn)染至EAhy926細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。將pcDNA、pcDNA-NEAT1、si-con、si-NEAT1分別轉(zhuǎn)染至正常EAhy926細(xì)胞中，用RT-qPCR檢測(cè)miR-217表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NEAT1和miR-217表達(dá)的影響 與NG組相比，HG組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NEAT1表達(dá)水平顯著降低，miR-217表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NEAT1和miR-217在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)

2.2過(guò)表達(dá)NEAT1和高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 與NG組相比，HG組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NEAT1、CyclinD1表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；與HG+pcDNA組相比，HG+pcDNA-NEAT1組NEAT1、CyclinD1表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2?？梢?jiàn)，過(guò)表達(dá)NEAT1促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

1～4：NG組、HG組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA-NEAT1組圖1 Western印跡檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CyclinD1表達(dá)

表2 過(guò)表達(dá)NEAT1和高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

2.3過(guò)表達(dá)NEAT1和高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 與NG組相比，HG組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Cleaved caspase-3表達(dá)水平及凋亡率顯著升高(P<0.05)；與HG+pcDNA組相比，HG+pcDNA-NEAT1組Cleaved caspase-3表達(dá)水平及凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表3?？梢?jiàn)，過(guò)表達(dá)NEAT1抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

圖2 過(guò)表達(dá)NEAT1和高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及Cleaved caspase-3表達(dá)的影響

表3 過(guò)表達(dá)NEAT1和高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

2.4NEAT1靶向miR-217調(diào)控其表達(dá) Targetscan預(yù)測(cè)顯示NEAT1與miR-217存在結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3。miR-217與WT-NEAT1共轉(zhuǎn)染的EAhy926細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。si-NEAT1組miR-217表達(dá)量(0.68±0.03)明顯低于si-con組(1.01±0.01)，pcDNA-NEAT1組miR-217表達(dá)量(0.44±0.06)明顯低于pcDNA組(0.94±0.09)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖3 NEAT1靶向miR-217

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5干擾miR-217和高糖誘導(dǎo)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與HG+anti-miR-con組相比，HG+anti-miR-217組CyclinD1表達(dá)水平及存活率明顯升高，cleaved caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖4。可見(jiàn)，干擾miR-217促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

1、2：HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-217組圖4 Western印跡檢測(cè)CyclinD1和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

2.6過(guò)表達(dá)NEAT1和miR-217對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與HG+pcDNA-NEAT1+miR-con組相比，與HG+pcDNA-NEAT1+miR-217組miR-217表達(dá)水平明顯升高，CyclinD1表達(dá)水平及細(xì)胞存活率明顯降低，cleaved caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表6?？梢?jiàn)，過(guò)表達(dá)miR-217可逆轉(zhuǎn)NEAT1對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖促進(jìn)和凋亡抑制的作用。

1、2：HG+pcDNA-NEAT1+miR-con組、HG+pcDNA-NEAT1+miR-217組圖5 Western印跡檢測(cè)CyclinD1和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

DM引起的慢性血管并發(fā)癥嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量，危害極大〔11〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與DM血管病變密切相關(guān)，高濃度葡萄糖能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔12〕。lncRNA和miRNA均屬于非編碼RNA，與DM血管病變疾病密切相關(guān)，可為其基因診斷與治療提供新靶點(diǎn)、新思路、新方法〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1通過(guò)激活miR-181d-5p/CDKN3軸可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔14〕。NEAT1還介導(dǎo)三甲胺N-氧化物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖〔15〕。CyclinD1是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白〔16〕；cleaved caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白〔17〕，其表達(dá)水平影響細(xì)胞增殖和凋亡。本研究結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)NEAT1可抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。

研究報(bào)道顯示高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-217表達(dá)上調(diào)〔18〕，本研究結(jié)果表明高糖處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中miR-217高表達(dá)。高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞中，miR-217通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt1/HIF-1α通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)及纖維化〔19〕。抑制miR-217通過(guò)恢復(fù)PTEN介導(dǎo)的自噬途徑可預(yù)防高葡萄糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷和胰島素抵抗〔20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明抑制miR-217表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。NEAT1可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-217影響高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡。