孫靜 盛天強(qiáng) 姚鵬 孫文華 詹芬芳 陳勇 胡衍輝 余樹(shù)春 徐國(guó)海

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科 江西省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006；2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3湖北省孝感市中心醫(yī)院；4江西省高安市婦幼保健院)

缺血缺氧性腦血管疾病迄今尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法。研究表明，炎性機(jī)制是腦缺血再灌注損傷的最重要機(jī)制之一，腦缺血損傷誘導(dǎo)炎性細(xì)胞激活和大量炎性細(xì)胞因子釋放在腦缺血損傷過(guò)程中有重要作用〔1，2〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2在炎性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究表明，MMP-2在心肌缺血再灌注損傷發(fā)生后表達(dá)明顯升高，而通過(guò)使用MMP-2抑制劑(TIMP-2)可有效緩解缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心功能惡化〔3，4〕，但MMP-2參與缺血性腦血管病的確切機(jī)制尚不清楚。本研究探討MMP-2在腦缺血缺氧炎性反應(yīng)中的作用及調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物選擇及分組 健康雄性SD大鼠(購(gòu)于南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部)48只，4～6周齡，體重200～220 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、局灶性腦缺血/再灌注損傷模型組(IR組)、TIMP-2組(T組)。IR組和T組采用線栓法進(jìn)行大鼠腦缺血2 h再灌注制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型，T組于模型制備前給予TIMP-2，Sham組僅分離、結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，不置入線栓。

1.2模型建立 參照文獻(xiàn)〔5〕方法建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型。腹腔注射10%水合氯醛(2 mg/kg)進(jìn)行麻醉，將大鼠仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。碘伏消毒頸部皮膚并鋪無(wú)菌洞巾，取正中切口切開(kāi)皮膚筋膜，鈍性分離肌肉至頸動(dòng)脈鞘，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。隨后在頸總動(dòng)脈分叉處用眼科剪剪開(kāi)小口，將線栓(直徑 0.26 mm，長(zhǎng)5 cm)置入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈約2 cm，生理鹽水沖洗后逐層縫合，2 h后提拉線栓至頸總動(dòng)脈內(nèi)。術(shù)中用烤燈照射維持大鼠體溫(36±1)℃，術(shù)后肌注青霉素10萬(wàn)U/只。

1.3神經(jīng)功能缺失體征(NDS)評(píng)分 參照Longa等〔6〕評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常者，計(jì)0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，計(jì)1分；動(dòng)物爬行時(shí)出現(xiàn)向左轉(zhuǎn)圈追尾現(xiàn)象，計(jì)2分；身體向偏癱側(cè)傾倒者，計(jì)3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失者，計(jì)4分。

1.4血腦屏障通透性檢測(cè) 使用伊文思藍(lán)(EB)注射法評(píng)價(jià)血腦屏障通透性。使用10%水合氯醛麻醉大鼠。隨后經(jīng)股靜脈注入2% EB溶液，2 h后打開(kāi)胸腔，通過(guò)升主動(dòng)脈灌注生理鹽水200 ml，斷頭取腦，用冰生理鹽水沖洗。擦干后稱重，加入2 ml 50%三氯乙酸溶液勻漿，4℃ 1 000 r/min離心15 min，取上清液，加入等體積無(wú)水乙醇。使用分光光度計(jì)檢測(cè)620 nm處吸光度OD值，并計(jì)算腦組織中EB含量。

1.5MMP-2蛋白表達(dá)的測(cè)定 采用Western印跡法進(jìn)行檢測(cè)。取大鼠腦組織，液氮研磨后提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，標(biāo)記后-20℃保存。各取蛋白樣品上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，80 V恒壓電泳至指示帶分離，隨后250 mA恒流轉(zhuǎn)移120 min至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入MMP-2一抗(稀釋度1∶1 000，Abcam公司，美國(guó))、β-actin一抗(稀釋度1∶1 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司)4℃孵育過(guò)夜。次日TBST緩沖液漂洗后孵育辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶6 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯影，Image Lab 拍照分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6熒光定量PCR檢測(cè)MMP-2基因mRNA表達(dá)水平 取大鼠腦組織，液氮研磨后制備腦組織勻漿，Trizol法提取腦組織總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度，-80℃保存。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查找MMP-2、β-actin引物序列(由華大基因合成)如下：MMP-2：上游引物5′-CTCTTCCATCCAACATGGATAGCTG-3′，下游引物5′-ACTCCAACTGTGAAGATCCGCTGA-3′。β-actin：上游引物5′-ATATCGCTGCGCTGGTC-3′，下游引物5′-ACCCATTCCCACCATCACAC-3′。反應(yīng)條件：42℃孵育15 min，85℃加熱5 s；94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參，使用公式2-△△Ct計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.7微板法測(cè)定腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及髓過(guò)氧化酶(MPO)含量 斷頭取腦，冰生理鹽水沖洗后加入組織提取液后使用勻漿器充分勻漿，4℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行上樣，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度值，并按說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算SOD、MDA及MPO含量。

1.8酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β含量 取大鼠腦組織，液氮研磨后制備腦組織勻漿，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清。按照說(shuō)明書(shū)步驟加入標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)液，使用酶標(biāo)儀上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清TNF-α、IL-1β含量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.13組各時(shí)間點(diǎn)NDS評(píng)分比較 Sham組未見(jiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀。與Sham組比較，IR組和T組再灌注4、8、24、72 h(T1～T4)時(shí)NDS評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時(shí)NDS評(píng)分顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組各時(shí)點(diǎn)NDS評(píng)分比較分,n=4)

2.23組各時(shí)間點(diǎn)腦組織EB含量比較 與Sham組比較，IR組和T組T1～T4時(shí)腦組織EB含量顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時(shí)腦組織EB含量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 3組各時(shí)點(diǎn)腦組織EB含量比較

2.33組各時(shí)間點(diǎn)腦組織MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 與Sham組比較，IR組和T組T1～T4時(shí)腦組織MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時(shí)腦組織MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.43組各時(shí)間點(diǎn)腦組織MPA、SOD、MPO含量比較 與Sham組比較，IR組和T組T1～T4時(shí)腦組織MDA及MPO含量顯著升高，SOD含量顯著降低(P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時(shí)腦組織MDA及MPO含量顯著降低，SOD含量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.53組各時(shí)點(diǎn)腦組織TNF-α及IL-1β含量比較 與Sham組比較，IR組和T組T1～T4時(shí)腦組織TNF-α及IL-1β含量顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，T組T1～T4時(shí)腦組織TNF-α及IL-1β含量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表5。

3 討 論

線栓法是制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型的常用方法之一，其操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好且可靈活調(diào)整缺血及再灌注的處理時(shí)間。本研究顯示，IR組大鼠在采用線栓法進(jìn)行腦缺血2 h再灌注后出現(xiàn)左前肢不能伸展、爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈等行為，NDS評(píng)分及血腦屏障通透性明顯升高，腦組織炎性因子水平及氧化應(yīng)激水平表達(dá)明顯升高，表明模型制備成功。

研究表明，腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程主要包括能量耗竭、酸中毒、興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基損傷、炎性細(xì)胞因子損傷及一氧化氮毒性作用等病理機(jī)制〔7～9〕，除缺氧和能量代謝衰竭外，由缺血誘導(dǎo)的一系列瀑布樣效應(yīng)是導(dǎo)致缺血性神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制。本研究提示大鼠在腦缺血再灌注損傷可出現(xiàn)血腦屏障損傷、大量炎性因子釋放及氧化應(yīng)激損傷，從而出現(xiàn)腦損傷。

血腦屏障作為機(jī)體維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在腦缺血再灌注損傷中占有重要地位。血腦屏障損傷是腦缺血的重要表現(xiàn)，而血腦屏障損傷又將進(jìn)一步加重腦損傷，引起腦水腫、氧化應(yīng)激損傷及炎性反應(yīng)等，甚至導(dǎo)致腦死亡〔10〕。MMPs在正常腦組織中不表達(dá)或低表達(dá)，當(dāng)腦缺血再灌注時(shí)，MMPs激活導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，引起血管源性腦水腫及繼發(fā)性神經(jīng)炎性反應(yīng)，并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷〔11〕。血管基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)是維持血腦屏障完整性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而MMPs是一類能降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的蛋白水解酶，其中MMP-2為明膠酶，是MMPs家族中的主要成員，在正常的腦組織中呈低水平表達(dá)，并與TIMP-2共同形成隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)平衡，維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后，MMPs與TIMPs平衡失調(diào)，MMP-2的表達(dá)增加，MMP-2通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致血腦屏障的通透性增加，促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生，在腦缺血再灌注和出血轉(zhuǎn)化過(guò)程中扮演重要的角色〔12，13〕。本研究參照Szychowski等〔14〕研究并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇TIMP-2的給藥方式及計(jì)量，結(jié)果提示TIMP-2可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制與其減輕大鼠氧化應(yīng)激損傷、降低炎性反應(yīng)、改善血腦屏障的通透性及下調(diào)MMP-2表達(dá)有關(guān)。TIMPs是MMPs特異性抑制因子，其通過(guò)與酶和酶原的催化位點(diǎn)結(jié)合，使酶失活或阻止酶的活性。TIMP-2是一種可溶性分泌蛋白，其可選擇性抑制MMP-2，對(duì)抗MMP-2的活性，減輕腦缺血再灌注后的神經(jīng)損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)〔15〕。

綜上，TIMP-2可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制與下調(diào)MMP-2表達(dá)有關(guān)。