申海艷 周靜 肖麗娜 馬武開 姚血明 陳琳 韓珊

(1貴州省骨科醫(yī)院骨外科，貴州 貴陽 550001；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；3貴州中醫(yī)藥大學(xué))

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種因關(guān)節(jié)軟骨損傷、退變而引發(fā)的慢性關(guān)節(jié)病。其癥狀表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)腫脹、僵硬、膝關(guān)節(jié)酸痛及活動(dòng)受限。老年女性發(fā)病率高，中后期可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、甚至廢用，使患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降〔1〕。目前臨床治療KOA主要以緩解癥狀為主。苗藥五藤膏作為貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院長期用于治療KOA的臨床外治經(jīng)驗(yàn)方，課題組前期臨床研究已顯示可有效緩解老年KOA患者關(guān)節(jié)疼痛、僵硬等臨床癥狀，治療KOA療效確切〔2～5〕。KOA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有研究認(rèn)為被激活的Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)參與了骨關(guān)節(jié)炎的病理過程，其表達(dá)水平在Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮了重要作用，Wnt通路的關(guān)鍵蛋白能夠顯著降低KOA軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13、原癌基因(c-myc)等靶基因的表達(dá)量〔6〕。由于β-catenin表達(dá)能夠使下游Wnt基因MMPs、c-myc等異常表達(dá)，因此正常水平的β-catenin對(duì)軟骨細(xì)胞發(fā)揮正常功能尤為重要。本研究通過建立KOA模型，從細(xì)胞及分子水平探討不同劑量苗藥五藤膏干預(yù)相應(yīng)的時(shí)間對(duì)KOA模型家兔關(guān)節(jié)軟骨β-catenin蛋白及MMP-13、c-myc表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2019年3～6月選取同一批4～5月齡健康家兔96只，體重1.5～2.5 kg，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供，遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20～25℃，濕度50%～60%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黔)2018-0012。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 苗藥五藤膏(黑骨藤30 g、大血藤30 g、小花青風(fēng)藤30 g、香血藤30 g和絡(luò)石藤30 g打成細(xì)粉與凡士林按1∶1的比例混合制成)，本實(shí)驗(yàn)藥物為貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑(黔藥制字Z20120072)，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供。使用前均勻?qū)⑽逄俑嗤坑诩啿忌献龀少N膏。氟比洛芬巴布膏，生產(chǎn)廠家：日本三笠制藥株式社會(huì)，規(guī)格：40 mg，批號(hào)：J20160090。

1.3主要儀器和試劑 DYCZ-24DN電泳槽(北京六一儀器廠)、HI650離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、MUTISKANMK3酶標(biāo)儀(Thermo)、QuantStudio6實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀(ABI)、TS8080灰度掃描儀(Canon)、JY02S超微量紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；BCA試劑盒(廠家：Beyotime，批號(hào)：P0010)、蛋白marker10-250 kD(廠家：海利克思，批號(hào)：P12103-2)、兔多抗P-β-catenin(85 kD)(廠家：LSBio，批號(hào)：LS-C356001-100)、兔多抗GAPDH(37 kD)(廠家：杭州賢至生物有限公司，批號(hào)：AB-P-R 001)、Trizol(廠家：Ambion，批號(hào)：15596-026)、DL2000 DNA Marker(廠家：TIANGEN，批號(hào)：MD114-02)。

1.4分組與給藥

1.4.1動(dòng)物分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，將96只家兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即：①空白組；②模型組；③巴布膏對(duì)照組；④五藤膏高量組(約4 g)；⑤五藤膏中量組(約2 g)；⑥五藤膏低量組(約1 g)；每組各16只。

1.4.2構(gòu)建兔KOA模型 為了盡量減少或避免對(duì)家兔膝關(guān)節(jié)的人為損傷，更好地模擬人KOA的疾病發(fā)展，反映中醫(yī)外治法對(duì)兔KOA的治療作用；采用經(jīng)典的木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射方法制備兔KOA模型〔7〕，將4%的木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.3 ml分別于第1、4、7天注入兔右膝關(guān)節(jié)，第7天注射完畢后，不再進(jìn)行任何干預(yù)(整個(gè)造模過程由指導(dǎo)小組成員協(xié)助完成)。正常飼養(yǎng)4 w后，通過組織切片觀察造模，建立穩(wěn)定的兔KOA模型。

1.4.3給藥方法 從造模后第5周開始干預(yù)治療，空白組不做任何干預(yù)，正常飼養(yǎng)。模型組患膝無菌紗布包扎固定，其余各組分別給予氟比洛芬巴布膏貼敷及不同劑量五藤膏貼敷干預(yù)；各治療組家兔藥物使用劑量均為人體等效劑量〔8〕，氟比洛芬巴布膏和苗藥五藤膏面積約為4 cm×3 cm，氟比洛芬巴布膏(約2 g)，五藤膏高量組(約4 g)、中量組(約2 g)、低量組(約1 g)。將五藤膏均勻涂于紗布上做成貼膏，直接敷貼于兔患膝關(guān)節(jié)面，藥物能覆蓋患肢膝關(guān)節(jié)，用繃帶包扎固定8 h防止藥物掙脫，1次/d。給藥后1、2、3、4 w各處死4只，在右側(cè)膝關(guān)節(jié)剝除皮膚取軟骨進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5指標(biāo)檢測(cè) Western印跡檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)Wnt信號(hào)下游基因MMP-13、c-myc mRNA的表達(dá)。

1.5.1qRT-PCR檢測(cè) 內(nèi)參為GAPDH，引物合成是武漢擎科公司，在NCBI網(wǎng)站完成引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證。見表1。Trizol法提取樣本總RNA：取凍存軟骨組織(-80℃)，剪碎，研磨，加入Trizol試劑，勻漿完成后靜置加入氯仿，離心，可見RNA-蛋白-DNA三相。將上層RNA轉(zhuǎn)移EP管中加入異丙醇，離心得到白色RNA沉淀；根據(jù)說明書操作，最后取焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后的RNA測(cè)定、計(jì)算樣本RNA濃度，進(jìn)行qRT-PCR；采用2-△△Ct分析最終目的基因的表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.5.2Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 根據(jù)說明書要求，完成蛋白樣品的制備及提取，即：稱量后將軟骨組織塊剪碎，液氮研磨和鋼珠(鋼珠直徑：0.9～2.0 mm混合)研磨。加裂解液裂勻漿，裂解，離心，稀釋牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品。將蛋白樣品、標(biāo)準(zhǔn)蛋白按組依次加入96孔板內(nèi)，將BCA試劑盒混合后加入96孔板內(nèi)(200 μl/孔)。37℃溫箱孵育后酶標(biāo)儀測(cè)OD值(OD568)。算出樣品蛋白濃度。最后凝膠分析軟件分析灰度值。

1.5.3關(guān)節(jié)病理觀察 軟骨取材后，病理標(biāo)本經(jīng)中性甲醛溶液固定、脫鈣、透蠟包埋等處理，蘇木素-伊紅(HE)染色(由專人檢測(cè)、觀察病理標(biāo)本)，病理改變參考改良版Mankin〔9〕評(píng)分對(duì)患膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本造模情況進(jìn)行分析并評(píng)分。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組關(guān)節(jié)軟骨病理改變比較 干預(yù)4 w后，空白組關(guān)節(jié)面軟骨無退行性改變，軟骨細(xì)胞無變性、萎縮，分布均勻；模型組關(guān)節(jié)面軟骨重度退行性改變，軟骨細(xì)胞重度變性、萎縮，分布紊亂；巴布膏對(duì)照組關(guān)節(jié)面軟骨輕度退行性改變，軟骨細(xì)胞輕度變性、萎縮，分布輕度紊亂；五藤膏低、中、高量組，量越低越接近模型組的退變程度；量越高，越接近空白組的細(xì)胞分布和數(shù)量，軟骨退變程度越低。見圖1。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨病理改變(HE，×200)

2.2各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理改良版Mankin評(píng)分比較 空白組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理Mankin評(píng)分〔(0.90±0.74)分〕顯著低于模型組〔(2.30±1.25)分，P<0.05〕，五藤膏低、中、高量組〔(7.80±0.63)、(4.80±0.63)、(3.40±0.70)分〕及巴布膏對(duì)照組〔(4.70±0.82)分〕兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理Mankin評(píng)分均低于模型組，除低量組外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；五藤這各量組內(nèi)比較，評(píng)分從低到高分別為高量組、中量組、低量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組β-catenin蛋白表達(dá)水平比較 模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織β-catenin表達(dá)水平(0.08±0.03)最低，空白組表達(dá)水平(0.52±0.06)最高，模型組、五藤膏低量組(0.20±0.06)、中量組(0.31±0.02)β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯低于空白組(t=11.380,P=0.000；t=6.321,P=0.003;t=5.827,P=0.004)；五藤膏低、中、高(0.38±0.08)量組、巴布膏對(duì)照組(0.44±0.03)β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯高于模型組(t=2.886,P=0.045;t=11.880,P=0.000;t=5.913,P=0.004;t=15.840,P=0.000);五藤膏低、中量組β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯低于巴布膏對(duì)照組(t=5.812,P=0.004;t=7.512,P=0.002)；五藤膏低量組β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯低于五藤中、高量組(t=2.935,P=0.043;t=3.043,P=0.038)。見圖2。

1～6：空白組；模型組；五藤膏低量組；五藤膏中量組；五藤膏高量組；巴布膏對(duì)照組圖2 各組干預(yù)4 w后軟骨組織中β-catenin蛋白表達(dá)

2.4各組不同時(shí)間點(diǎn)MMP-13 mRNA表達(dá)水平比較 與空白組相比，模型組、五藤膏低、中量組1～4 w MMP-13 mRNA的表達(dá)水平均均明顯高于空白組(P<0.05)，五藤膏高量組、巴布膏對(duì)照組1～4 wMMP-13 mRNA的表達(dá)水平略高于空白組，但無顯著差異(P>0.05)；與模型組相比，五藤膏低、中、高量組及巴布膏對(duì)照組1～4 w MMP-13 mRNA的表達(dá)水平均明顯低于模型組(P<0.05)。治療組組內(nèi)比較，五藤膏低量組1～4 w MMP-13 mRNA的表達(dá)水平均明顯高于五藤膏中、高量組及巴布膏對(duì)照組(P<0.05)，但五藤膏中、高量組及巴布膏對(duì)照組比較無顯著差異(P>0.05))。見表1。

2.5各組不同時(shí)間點(diǎn)c-myc mRNA表達(dá)水平比較 模型組、五藤膏各量組1～4 w c-myc mRNA表達(dá)水平均明顯高于空白組(均P<0.05)；五藤膏各量組及巴布膏對(duì)照組1～4 w c-myc mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組(均P<0.05)；模型組、五藤膏低、中量組1～4 w c-myc mRNA表達(dá)水平均明顯高于巴布膏對(duì)照組(均P<0.05)；五藤膏低量組1～4 w c-myc mRNA表達(dá)水平均明顯高于五藤膏高量組(均P<0.05)；五藤膏低量組第4周c-myc mRNA表達(dá)水平明顯高于五藤膏中量組(P<0.05)；五藤膏中量組1 w c-myc mRNA表達(dá)水平明顯高于五藤膏高量組(P<0.05)，見表2。

3 討 論

KOA的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，病理學(xué)變化可見骨贅、半月板、關(guān)節(jié)囊及軟骨組織病變。生物學(xué)改變?yōu)檠装Y細(xì)胞因子、代謝因子、基質(zhì)成分等表達(dá)異常，使膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡失衡，導(dǎo)致KOA的發(fā)生。β-catenin作為Wnt信號(hào)的樞紐蛋白，主要在細(xì)胞膜、細(xì)胞核中存在〔10〕，且具有細(xì)胞黏附及信號(hào)傳遞活性。有研究顯示，過度上調(diào)β-catenin表達(dá)，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，影響其通路下游的相關(guān)基因表達(dá)，如MMP-13，而MMP-13作為MMPs中最有效的Ⅱ型膠原降解酶，可加速軟骨細(xì)胞降解、凋亡〔11〕，但阻止β-catenin的表達(dá)或其表達(dá)過低也可加速軟骨細(xì)胞降解、凋亡，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生〔12〕。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路時(shí)通常以上調(diào)或下調(diào)Wnt蛋白及關(guān)鍵因子(β-catenin)，促進(jìn)其軟骨細(xì)胞增殖或抑制相關(guān)基因的表達(dá)，從而起到治療KOA 的作用〔13〕。β-catenin是一種具有高度保守和穩(wěn)定的多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，且作為胞質(zhì)蛋白及轉(zhuǎn)錄蛋白存在于各種類型的細(xì)胞膜、胞質(zhì)和胞核中，是核膜共表達(dá)蛋白〔14〕，在軟骨細(xì)胞的分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用〔15〕。β-catenin與細(xì)胞膜上的鈣黏蛋白作用發(fā)揮其黏附功能，當(dāng)上調(diào)β-catenin蛋白的表達(dá)時(shí)，其胞間黏附作用也隨之增強(qiáng)，可抑制軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、分化及骨下成骨轉(zhuǎn)化，但當(dāng)下調(diào)β-catenin蛋白的表達(dá)時(shí)，黏附功能減弱，則可加速細(xì)胞間相關(guān)因子的轉(zhuǎn)運(yùn)；β-catenin作為具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的Wnt信號(hào)下游元件，又參與到軟骨細(xì)胞增殖過程中。所以作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，β-catenin表達(dá)水平對(duì)KOA中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)揮正常功能尤為重要，是干預(yù)、治療KOA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

軟骨主要由細(xì)胞外基質(zhì)組成，其中Ⅱ型膠原降解酶占60%，MMP-13可優(yōu)先將其降解，破壞關(guān)節(jié)軟骨。最新研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控下游MMPs和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族基因的表達(dá)水平〔16〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎中存在許多蛋白酶，其中MMPs作為軟骨基質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白酶，以MMP-3、13與KOA發(fā)病過程關(guān)系最為緊密〔17〕。MMPs的主要病理作用有組織破壞(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等)，基質(zhì)降解(如再狹窄性病變)等；MMP-13通常不存在正常組織細(xì)胞中，而常分布于病理性組織重構(gòu)及關(guān)節(jié)炎等環(huán)境中。研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13表達(dá)較高，且過度上調(diào)β-catenin的表達(dá)，可增加MMP-13基因的表達(dá)量，使c-myc的表達(dá)產(chǎn)生異常，使通路下游軟骨基質(zhì)降解，增加軟骨細(xì)胞的分化、增殖速度，破壞關(guān)節(jié)軟骨〔18～21〕。

本研究結(jié)果證明β-catenin不僅與KOA發(fā)生發(fā)展有很大的關(guān)聯(lián)性，同時(shí)也與KOA軟骨組織的病變進(jìn)程有很大的相關(guān)性，苗藥五藤膏可通過軟骨組織抑制其表達(dá)，說明其通路的下游基因MMP-13、c-myc與KOA的發(fā)生發(fā)展也有著密切聯(lián)系，且其表達(dá)水平與疾病進(jìn)程有很大的相關(guān)性，證實(shí)MMP-13、c-myc mRNA的表達(dá)與KOA關(guān)節(jié)軟骨退變程度及疾病進(jìn)展呈正相關(guān)。