石桃雄，朱麗偉，王紅霞，黃 娟，陳慶富

（貴州師范大學蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴陽 550001）

褪黑素是一種小分子激素類物質(zhì)，在1917年被首次發(fā)現(xiàn)于牛腦松果體中，該種未知物質(zhì)可以讓蛙皮膚黑色素褪色變白［1］。至1958年，褪黑素的化學結(jié)構(gòu)才被鑒定出，命名為Melationin［2］。1969—1995年，又有很多學者相繼在不同地區(qū)的被子植物中檢測出該種物質(zhì)，含量較低，為ng/g水平［3，4］。但在某些藥用植物的種子中，褪黑素含量可達μg/g水平［5］。

近年來，隨著人們對褪黑素研究的深入，發(fā)現(xiàn)褪黑素在植物抗逆性反應(yīng)中至關(guān)重要。徐向東等［6］研究了外源褪黑素對高溫脅迫下黃瓜幼苗活性氧（ROS）代謝的影響，發(fā)現(xiàn)褪黑素能抑制黃瓜葉片ROS產(chǎn)生，提高抗氧化酶系的活性和抗氧化物質(zhì)的占比，維持脂膜的完好性，增強幼苗對高溫逆境的抵抗能力。Zhang等［7］研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠顯著提高鹽脅迫下黃瓜種子的發(fā)芽率，以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，外源褪黑素能誘導(dǎo)抗氧化物質(zhì)基因表達以減少鹽脅迫引起的氧化損傷。Li等［8］研究發(fā)現(xiàn)，施加1μmol/L褪黑素能夠減少湖北海棠葉片氧化損傷，減緩葉綠素的降解，提升葉片的光合速率，有效緩和鹽脅迫對湖北海棠生長的脅制作用。鹽脅迫對大豆苗期鐵氧還蛋白基因PetF的表達也具有抵制作用，而添加適宜濃度褪黑素能夠加強大豆中該基因的表達［9］。褪黑素能提高小麥幼苗的耐旱能力，使其根系的吸水能力變強，還可使其氣孔張開，蒸騰作用速度加快，提升植物光合能力，使其快速恢復(fù)生長［10］。多胺能維持細胞的完整性，減輕低溫造成的細胞膜傷害。研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理煙草懸浮細胞后，細胞內(nèi)精氨酸脫羧酶活性增強，致使細胞內(nèi)多胺的含量增加，以提高對低溫的抗性［11］。

蕎麥生長周期短（80～100 d）、抗旱、耐瘠，營養(yǎng)和保健作用良好，是中國重要的小宗雜糧作物。蕎麥膳食纖維高于小麥、大米和玉米等谷類作物，且含有谷類作物沒有的蘆?。ňS生素P）和葉綠素等成分，能降低人體血脂和膽固醇含量，有抗輻射、抗氧化、防治心血管病和腦血管出血等作用［12］。鹽脅迫是造成農(nóng)作物生長危害的主要原因之一，土壤鹽漬化對全球農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要影響。為了充分利用鹽漬化土地，抗逆性強且營養(yǎng)價值豐富的蕎麥成為適宜的作物之一。為研究褪黑素對苦蕎鹽抗性的作用，本研究以苦蕎自交系WTX2為試驗材料，研究褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎的萌發(fā)、根長、幼苗鮮干重、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性的變化規(guī)律，以期為提高苦蕎耐鹽能力研究提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苦蕎種子由貴州師范大學蕎麥研究中心提供，為穩(wěn)定的苦蕎自交系WTX2，種子在做此研究前先進行了鹽濃度篩選，最終選取了濃度為100 mmol/L的NaCl溶液；褪黑素處理條件為25℃的黑暗環(huán)境。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)芽試驗

1）溶液配制。100 mmol/L的NaCl溶液：取5.85 g NaCl溶解后，定容至1 000 mL，備用。1 000μmol/L的褪黑素溶液：取褪黑素0.232 3 g，用微量無水乙醇溶解后定容到1 000 mL。用水稀釋配制成濃度為100和1 000μmol/L褪黑素溶液。褪黑素溶液配制過程盡量避光，然后將配好的溶液避光保存于4℃冰箱中備用。

2）種子精選。選取均勻飽滿的WTX2種子，放入去離子水中多次沖洗，祛除雜質(zhì)，進行二次篩選。最后，將精選好的種子自然風干，分別用不同濃度的褪黑素于黑暗條件下處理6 h后取出，水處理作為對照（CK），晾干，備用。

3）發(fā)芽管理。試驗用的發(fā)芽盒規(guī)格為12 cm×12 cm，盒底部鋪雙層充分浸泡過鹽溶液的發(fā)芽紙，然后將苦蕎種子播于發(fā)芽紙上，放入智能光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為25℃，16 h光照和8 h黑暗條件下循環(huán)。以胚根突破種皮1 mm為發(fā)芽標準，每日固定時間記錄發(fā)芽種子數(shù)，并及時給發(fā)芽紙補充NaCl溶液保持脅迫。在培養(yǎng)的第7天，每個處理取20棵幼苗，分別測根長、鮮重和干重。

1.2.2 酶液制備 分別在培養(yǎng)的第0、2、4和6天時取樣測定丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性。取0.3 g苦蕎幼苗，分3次加入8 mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.8），研磨至勻漿狀態(tài)，在10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液作為酶粗提取液。各項指標參考《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》中的方法［13］。其中，MDA測定采用硫代巴比妥酸法；SOD測定采用氮藍四唑（NBT）還原法；CAT測定采用H2O2法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件結(jié)合SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行整理、方差分析和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對鹽脅迫下苦蕎種子萌發(fā)的影響

由表1可知，不同濃度褪黑素處理后，苦蕎種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時間均和對照無顯著差異，而經(jīng)1 000μmol/L褪黑素處理后，種子的活力指數(shù)顯著高于CK，說明適宜濃度的褪黑素處理可明顯提高苦蕎種子的耐鹽能力。

表1 褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎種子萌發(fā)的影響

2.2 外源褪黑素對鹽脅迫下苦蕎根長和生物量的影響

由表2可知，與CK相比，100和1 000μmol/L褪黑素處理的種子在高鹽條件萌發(fā)時，其幼苗各項指標均較好。使用1 000μmol/L褪黑素處理后的種子幼苗根比CK長29.2%，幼苗鮮重和干重分別比CK高15.0%和15.4%。特別是幼苗鮮重顯著大于CK。

表2 褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎幼苗根長、鮮重和干重的影響

2.3 外源褪黑素對鹽脅迫下苦蕎幼苗MDA含量的影響

由圖1可知，高鹽脅迫下，苦蕎生長過程中其幼苗MDA含量均處于先下降后上升的趨勢，不同濃度褪黑素處理下幼苗MDA含量有一定的差異。CK處理的苦蕎種子在萌發(fā)第0、2和4天時幼苗MDA含量差異不顯著，但在萌發(fā)第6天時含量顯著升高，比第4天高258.2%；在施加褪黑素為10、100和1 000μmol/L濃度時，種子萌發(fā)第2天之后幼苗MDA含量均顯著上升，但上升幅度均較CK低，與萌發(fā)第4天相比、第6天的MDA含量分別升高了111.7%、129.4%和37.0%。

圖1 褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎幼苗MDA含量的影響

2.4 外源褪黑素對鹽脅迫下苦蕎幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，各處理的種子在鹽脅迫萌發(fā)過程中，SOD酶活性都具有下降的變化趨勢，不同處理間又有明顯的區(qū)別。CK和10μmol/L處理的種子在萌發(fā)第0～4天時，SOD酶一直維持較高的活性，萌發(fā)至第6天時酶活性顯著下降，與第4天相比，分別下降了63.8%和51.2%；經(jīng)100和1 000μmol/L褪黑素處理的種子，在萌發(fā)第0～2天活性較高，萌發(fā)至第4天時活性有輕微下降，萌發(fā)至第6天時活性下降明顯，與第4天相比，分別下降了45.1%和29.0%，差異并未達到顯著水平。

圖2 褪黑素處理對鹽脅迫下苦蕎幼苗SOD酶活性的影響

由圖3可見，各處理的種子在高鹽脅迫萌發(fā)過程中，幼苗CAT酶活性均有不同程度的變化。CK處理的種子在萌發(fā)第0、2、4和6天時，CAT酶活性呈下降、上升又下降的變化趨勢，由萌發(fā)第0天的2.642 nmol/g·min（FW）降 至 第6天 的0.208 nmol/g·min（FW）；10μmol/L褪黑素處理的種子CAT酶活性呈先上升后下降的變化趨勢，在萌發(fā)第2天時，CAT酶活性顯著高于第0天，萌發(fā)第2～6天CAT酶活性呈緩慢下降的變化趨勢，不同萌發(fā)天數(shù)間差異不顯著；100μmol/L褪黑素處理的種子CAT酶活性呈下降的變化趨勢，萌發(fā)至第2天時CAT酶活性顯著低于第0天，萌發(fā)至第2～6天時CAT酶活性呈緩慢下降的變化趨勢，不同萌發(fā)天數(shù)間差異不顯著；1 000μmol/L褪黑素處理的種子萌發(fā)過程中CAT酶活性無顯著變化，萌發(fā)第0、2、4、6天時CAT酶活性分別是1.285、1.889、1.490和1.505 nmol/g·min（FW）。

3 討論

有研究表明，褪黑素可以促進小麥種子萌發(fā)，提高胚芽鞘長度和初生根數(shù)［14］，增加滁菊幼苗鮮重和干重［15］。水稻幼苗植株進行75 mmol/L Nacl脅迫15 d，噴灑200μmol/L褪黑素使植株干重顯著增加［16］。0.1～100μmol/L褪黑素處理明顯緩解水稻砷脅迫，其根長和鮮重均有明顯提高［17］。在本研究中，10μmol/L褪黑素處理對苦蕎應(yīng)對鹽脅迫促進作用有限。100、1 000μmol/L褪黑素處理顯著降低了苦蕎鹽脅迫的毒害作用，苦蕎種子活力指數(shù)、鮮重均明顯高于CK，根長和干重也高于CK。

在植物遭遇高低溫、鹽堿等逆境脅迫時，細胞膜透性會有所增加。植物體內(nèi)的丙二醛（MDA）含量是衡量細胞膜受氧化傷害程度最好的指標，其含量的大小可以直接反映細胞膜受傷的程度［18，19］。徐向東等［4］研究表明，施加外源褪黑素后的黃瓜幼苗葉片MDA的含量隨著褪黑素濃度的增大而減小，并且顯著低于對照組。黃益宗等［17］在砷脅迫下，對水稻葉片噴施0.1～100μmol/L褪黑素，也顯著減少水稻葉片MDA的累積。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，鹽脅迫會導(dǎo)致苦蕎幼苗中MDA含量增加，而褪黑素處理能有效緩解高鹽對細胞膜的傷害，降低苦蕎幼苗的MDA含量。

SOD和CAT是在植物保護系統(tǒng)中起重要作用的兩種酶，在植物處于逆境條件時，它們能通過相互協(xié)作，減少活性氧，降低植物細胞受傷害的程度［20］。在本研究中，鹽脅迫條件下，苦蕎種子經(jīng)100、1 000 μmol/L褪黑素處理后，SOD和CAT酶活性雖然也處于下降的變化趨勢，但與CK相比，其變化是緩慢的，且萌發(fā)至第6天時，褪黑素處理的種子幼苗CAT酶活性均明顯高于CK。本研究結(jié)果與劉仕翔等［21］、余雪娜等［22］、劉月等［23］研究結(jié)果一致，表明褪黑素處理植物可提高其抗氧化物酶系統(tǒng)活性，減少逆境條件下產(chǎn)生的活性氧，進而降低植物受傷害程度。

4 小結(jié)

使用100、1 000μmol/L褪黑素濃度處理苦蕎種子，可減緩高鹽對細胞膜的傷害作用，使SOD和CAT酶活性維持相對較高水平，顯著減緩高鹽對苦蕎幼苗的毒害作用，使幼苗的根長、鮮重和干重均優(yōu)于對照。