宋小珍，佟盼盼，任美靈，張 磊，買占海，況 玲，謝金鑫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

乳頭瘤病毒(Papillomavirus，PV)是一種小的、無(wú)囊膜的、基因組約8 kb的環(huán)狀、雙鏈DNA病毒[1]。病毒根據(jù)其L1基因開放閱讀框的核苷酸序列同源性分為不同種類的PVs[2-3]。PV可感染人、馬和牛等多種動(dòng)物。馬乳頭瘤病毒(Equuscaballuspapillomavirus，EcPV)1、2、3、4、5、6、7、8和9型，牛乳頭瘤病毒(Bovine papillomavirus，BPV)1、2和13型，和人乳頭瘤病毒18型(Human papillomavirus 18，HPV-18)已被證明能夠感染馬[2,4-10]。

馬乳頭瘤病毒包括皮膚乳頭狀瘤(EcPV-1)、生殖器乳頭瘤/乳頭瘤病(EcPV-2和EcPV-7)、耳乳頭瘤(EcPV-3、4、5和6)、全身性乳頭瘤病(EcPV-8)和馬肉瘤樣病變(BPV-1和BPV-2)[2,4,5,7-9]。EcPV-1首次分離于1986年，廣泛報(bào)道于國(guó)外3歲以下馬匹中，引起馬皮膚乳頭瘤病，該病發(fā)病期為1個(gè)月～9個(gè)月，然后自然消退[2,3]。因皮膚乳頭狀瘤的患病馬禁止交易、喪失觀賞價(jià)值，給馬產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。馬感染乳頭瘤病毒及其引起的乳頭狀瘤病在我國(guó)尚未見報(bào)道。事實(shí)上，僅報(bào)道過臨床健康馬糞便樣品攜帶HPV-18[10]。2018年6月，本課題組在新疆昌吉市某馬術(shù)俱樂部8歲純血種公馬鼻腔內(nèi)觀察到乳頭狀瘤樣組織，因乳頭狀瘤樣組織阻塞鼻腔，臨床表現(xiàn)呼吸困難?；诟咄繙y(cè)序，在乳頭狀瘤樣組織中檢測(cè)到EcPV-1。為進(jìn)一步了解我國(guó)EcPV-1分子特征，對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)定和分析，為新疆地區(qū)該病毒流行病學(xué)研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 采集新疆昌吉某馬場(chǎng)編號(hào)為G2的8歲純血種公馬鼻內(nèi)乳頭瘤樣組織和140匹健康純血馬鼻拭子樣品，置-80℃保存。

1.1.2 主要試劑 組織DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒，旭基公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，Takara公司產(chǎn)品；2×TransStart?FastPfu Fly PCR SuperMix、pEASY?-Blunt T、Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞和卡那霉素，全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀和電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄的EcPV-1參考株設(shè)計(jì)用于全基因序列擴(kuò)增的12對(duì)特異性引物，引物使用濃度10 μmol/L，引物由青島派森諾生物技術(shù)股份有限公司合成(表1)。

表1 EcPV-1全基因組PCR引物

1.2.2 EcPV-1全基因序列測(cè)定 按照試劑盒方法提取馬鼻腔內(nèi)乳頭瘤樣組織樣品DNA，以腫瘤樣品提取的DNA為模板，采用表1中特異性引物，PCR擴(kuò)增G2株全基因組，反應(yīng)條件：98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化回收，并克隆于pEASY?-Blunt T中，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.2.3 EcPV-1同源性及遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)GenBank中登錄的相關(guān)序列，采用DNA Star軟件對(duì)EcPV-1基因核苷酸和氨基酸進(jìn)行同源性分析。利用MEGA7.0.26軟件采用最大似然法(Maximum Likelihood methods)構(gòu)建EcPV-1全基因組序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，步展值重復(fù)1 000次進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 乳頭瘤樣組織樣品的病毒宏基因組學(xué)分析

對(duì)采集的乳頭瘤樣組織樣品經(jīng)常規(guī)處理、PCR擴(kuò)增后經(jīng)病毒宏基因組學(xué)分析顯示，共獲得6 077 096條reads，長(zhǎng)度為150核苷酸(nucleotide,nt)。其中有6 054條reads(占全部序列的0.01%)注釋到哺乳動(dòng)物病毒，分屬于6個(gè)已知的病毒科和未分類的病毒，包括EcPV-1(2609 reads)、反轉(zhuǎn)錄病毒(109 reads)、圓環(huán)病毒樣病毒(217 reads)、小雙節(jié)RNA病毒(503 reads)、白血病病毒(313 reads)、諾如病毒(53 reads)和未分類病毒(2250 reads)。EcPV-1 2 609條reads注釋到病毒的E6和L1基因，與EcPV-1參考株E6和L1基因核苷酸序列同源性為98.8%～99.8%。根據(jù)馬匹編號(hào)(G2)，將高通量測(cè)序檢測(cè)到的EcPV-1命名為G2株。

2.2 EcPV-1 G2株全基因組序列測(cè)定

根據(jù)馬匹編號(hào)(G2)，將本研究檢測(cè)到的EcPV-1命名為G2株。利用表1的12對(duì)特異性引物對(duì)G2株全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，均獲得相應(yīng)的目的條帶，膠回收、克隆測(cè)序后，目的條帶長(zhǎng)度分別為734、735、765、630、634、629、834、625、743、522、543、741 bp(圖1)。Lasergene SeqMan對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行拼接，得到G2株全基因組序列。該毒株全基因組序列為7 611 bp(GenBank登錄號(hào)為MN164462)，與EcPV-1美國(guó)株(AF498323)和日本株(MF288893)全基因組序列同源性為99.3%～99.4%。此外，未在同場(chǎng)30匹(<3歲)和110匹(>3歲)健康純血馬鼻拭子樣品中檢測(cè)到EcPV-1。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～12.PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000；1-12.Amplification products

2.3 EcPV-1 G2株全基因組分析

EcPV-1 G2株與EcPV-1參考株E6、E7、E1、E2、E4、L2和L1基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為99.0%～99.8%和97.7%～99.2%，而與EcPV-2-9參考株相應(yīng)基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為30%～60%和12.1%～56.7%(表2)。

表2 EcPV-1 G2全基因組分析

2.4 EcPV-1 G2株全基因組序列遺傳進(jìn)化分析

以上述11株EcPVs為參考株，利用MEGA7.0.26軟件構(gòu)建EcPV-1全基因組序列進(jìn)化樹，結(jié)果顯示G2株與EcPV-1參考株親緣關(guān)系較近，處于進(jìn)化分支中的Zata乳頭瘤病毒屬(圖2)，與EcPV-2-9形成的Dyoiota、Dyorho和Treikaappa乳頭瘤病毒屬進(jìn)化分支親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

▲本研究發(fā)現(xiàn)病毒▲Virus identified in this study

3 討論

已有報(bào)道顯示EcPV-1感染3歲以下馬匹，引起良性的自限性的皮膚乳頭狀瘤[1-3]，在發(fā)病1個(gè)月～9個(gè)月后自愈[2-3]。本研究首次在8歲成年純血種公馬鼻腔內(nèi)觀察到乳頭狀瘤樣組織，并在該組織中檢測(cè)到EcPV-1，表明該病毒存在于我國(guó)馬群中，可感染年齡大于3歲的馬匹，引起其乳頭瘤病。本研究發(fā)現(xiàn)EcPV-1感染8歲馬導(dǎo)致鼻內(nèi)乳頭瘤，可能與該馬接觸到EcPV-1時(shí)間較晚有關(guān)，也可能與對(duì)馬鼻內(nèi)乳頭瘤的關(guān)注不夠有關(guān)。純血種公馬在患病15個(gè)月后未自愈，因乳頭狀瘤樣組織阻塞鼻腔，呼吸困難，種公馬不能完成配種工作。另外，盡管未在該馬場(chǎng)其他140匹純血馬鼻拭子樣品中檢測(cè)到EcPV-1，但患病馬攜帶該病毒具有潛在感染其他馬匹的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)同場(chǎng)馬匹健康產(chǎn)生威脅。患病馬已于2019年11月被淘汰處理。

Cook R H等[11]研究顯示EcPV-1感染馬匹66 d后產(chǎn)生皮膚乳頭狀瘤，本研究中患病純血種公馬于2012年購(gòu)自西歐，發(fā)病前有去昌吉市其他馬場(chǎng)的旅行史，同場(chǎng)其他馬匹鼻拭子樣品呈EcPV-1陰性，表明該純血種公馬在昌吉市其他馬場(chǎng)感染EcPV-1。

與EcPV-1參考株L1基因編碼框核苷酸序列相比，EcPV-1 G2 L1基因在192T、201A、206T、213T、215C、251C、252C、313A、330A、390T、443T、567T、597C、832C和973T位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，EcPV-1 G2與EcPV-1參考株L1基因編碼框核苷酸序列同源性為98.8%～99.1%。為了對(duì)新的PV進(jìn)行分類，將新鑒定的PV與已知PV L1基因編碼框核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，根據(jù)同源性命名為PV的新屬(同源性<60%)、種(同源性≥60%，<70%)、型(同源性≥70%，<90%)、亞型(同源性≥90%，<98%)和變異株(同源性≥98%，<100%)[2-4]，表明G2株為EcPV-1新變異株。

本研究首次在國(guó)內(nèi)鑒定EcPV-1，并對(duì)其全基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，為新疆地區(qū)該病毒的流行病學(xué)研究提供了參考依據(jù)。