郝 運 ，周沁怡,李 銳,楊 華,郝力力,唐 標*

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量安全與營養(yǎng)研究所，浙江杭州 310021；3.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京 210095)

細菌耐藥性問題已經(jīng)成為全球重要的公共衛(wèi)生問題?？股刂委熑撕蛣游锛膊⌒Ч怀?，給人和動物的健康帶來巨大福祉。然而,近年來在養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素，養(yǎng)殖從業(yè)人員過分依賴抗生素，甚至出現(xiàn)濫用抗生素的現(xiàn)象。許多養(yǎng)殖農(nóng)戶對于細菌耐藥性問題認識不足，認為只要大量使用抗生素，延長其使用時間就可以達到預防和治療疾病的效果?？股刈鳛榇偕L劑的大量使用，是導致致病菌出現(xiàn)耐藥性的主因。從國內(nèi)外的研究報道來看，大腸埃希氏菌、沙門氏菌等常見致病菌的耐藥性不斷升高，耐藥基因流行區(qū)域廣，且不斷出現(xiàn)新的變異耐藥基因。一些常見抗生素在動物疾病治療中已失去價值。王丹等[1]對哈爾濱地區(qū)分離的23株沙門氏菌的藥敏試驗結果顯示，對四環(huán)素的耐藥率最高，對氨芐西林、環(huán)丙沙星、慶大霉素等藥物的耐藥率僅為8.7%。Lei C W等[2]從山東、貴州等12個省份36個畜禽養(yǎng)殖場中分離到208株屎腸球菌和137株糞腸球菌，并從中檢測到19株有poxtA耐藥基因的菌株，這19株菌均對氯霉素、氟苯尼考、紅霉素和多西環(huán)素耐藥。另外，據(jù)江婷婷[3]等報道顯示，我國西南地區(qū)1999年、2003年、2006年3個不同時期豬源大腸埃希氏菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考等10種抗生素的耐藥性逐步增加。有報道提出，四川省分離的467株大腸埃希氏菌對阿莫西林和氨芐西林等藥物的耐藥率超過90%，遠高于2006年和2009年的報道6.6%～10.0%，高于2011年報道的51.4%[4]，這說明四川省大腸埃希氏菌、沙門氏菌和腸球菌的耐藥性也呈逐年增加趨勢，細菌耐藥問題不斷惡化。

對動物源細菌耐藥性進行連續(xù)監(jiān)測，可以及時了解耐藥性的發(fā)生和流行情況。雖然農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)對動物源細菌耐藥性問題展開研究，但是局部地區(qū)對動物源細菌耐藥性問題依然不夠重視。本文旨在總結四川地區(qū)常見動物源細菌的耐藥水平和耐藥基因的傳播特征，為省內(nèi)繼續(xù)開展耐藥監(jiān)測工作提供數(shù)據(jù)。

1 大腸埃希氏菌的耐藥現(xiàn)狀

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)俗稱大腸桿菌，屬于埃希氏菌屬，是革蘭氏陰性菌耐藥性水平指示菌。大腸埃希氏菌是條件致病菌，部分致病性大腸埃希氏菌是引起細菌性食物中毒的常見病原菌[5]。大腸埃希氏菌不僅可引起消化系統(tǒng)感染，還能導致腸道外其他臟器感染。研究表明，四川地區(qū)動物源大腸埃希氏菌廣泛被分離到，諸明欣[6]對四川阿壩州的牦牛源大腸埃希氏菌的分離率為19.17%(74/386)；徐俊杰[7]等對四川遂寧市的鴨源大腸埃希氏菌的分離率為96.67%(29/30)。

養(yǎng)殖場在動物養(yǎng)殖過程中通過飼喂抗生素來達到促生長的作用，在選擇壓力下，耐藥菌株不斷出現(xiàn)。根據(jù)研究報道總結四川地區(qū)大腸埃希氏菌的耐藥狀況如表1所示，其中阿莫西林、復方新諾明等藥物均出現(xiàn)耐藥率為100%的情況，氨芐西林、四環(huán)素等耐藥率也超過90%。其中對頭孢噻肟、頭孢曲松等藥物的耐藥率最低，這可能與禁止對動物使用第三代頭孢類藥物有關，但是動物源大腸埃希氏菌對第三代頭孢類藥物仍具有耐藥性，這可能與β-內(nèi)酰胺類抗生素的交叉耐藥性有關。但就2006年至2018年而言，大腸埃希氏菌對不同抗菌藥物的耐藥率普遍上升。

表1 四川省大腸埃希氏菌的耐藥率狀況

產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是大腸埃希氏菌重要的耐藥表現(xiàn)之一，臨床上常見的有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、碳青霉烯酶和頭孢菌素水解酶(AmpC)[9]。另外，近年來由于黏菌素大量使用，導致耐藥性迅速增高，黏菌素耐藥基因mcr除了mcr-1以外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8個變異型mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5、mcr-6、mcr-7、mcr-8[10]和mcr-9。2018年Liu L等[11]通過PCR測序發(fā)現(xiàn)了一株人源攜帶blaNDM耐藥基因的大腸埃希氏菌，與blaNDM-5相比，只有1個核苷酸差異(G205A)，并命名為blaNDM-21。該基因具有與blaNDM-5相同的抗碳青霉烯類抗生素活性，還發(fā)現(xiàn)該耐藥基因由IncX3類型質粒攜帶。2015年Kong L H等[12]從四川某豬場分離出105株大腸埃希氏菌，對其中耐藥基因研究結果顯示，16株同時攜帶blaNDM-5和mcr-1耐藥基因。2010年-2016年楊承霖等[13]分離到444株大腸埃希氏菌，對其耐藥基因的檢測率分別為blaTEM-1(63.3%)、blaTEM-52(32.1%)、blaCTX-M-55(42.2%)、blaCTX-M-65(27.8%)、blaCTX-M-14(21.1%)。2019年Bai L等[14]從四川分離得到的23株豬源大腸埃希氏菌中分離到2株tet(X4)陽性菌，并通過MLST分析鑒定出兩個屬于ST101基因型的菌株。2016年-2018年彭珂楠等[8]分離到豬源大腸埃希氏菌22株，并對其耐藥基因進行分析，結果發(fā)現(xiàn)sul2耐藥基因的陽性率最高為95.54%，其次是tet(B)(四環(huán)素類)陽性率為86.36%、tet(A)(四環(huán)素類)陽性率為81.82%、floR(酰胺醇類)陽性率為81.82%，blaOXA(β內(nèi)酰胺類)和blaSHV(β內(nèi)酰胺類)耐藥基因的陽性率最低，都是9.09%。2015年-2016年Chen D Y等[15]從四川省野生大熊貓的糞便樣本中分離到82株大腸埃希氏菌，有40%的菌株表現(xiàn)為多重耐藥，耐藥基因檢測結果顯示strB耐藥基因陽性率為32%，aph(3′)-IIa耐藥基因陽性率28%，ant(3″)-Ia耐藥基因的陽性率為23%，aadA1耐藥基因的陽性率為21%。aac(3)-Iia耐藥基因的陽性率為5%。綜上所述，四川省大腸埃希氏菌中流行耐藥基因較多，blaNDM、blaCTX、mcr-1等耐藥基因，四環(huán)素tet(A)、tet(M)、tet(B)耐藥基因，以及blaOXA、blaSHV、strB、aph(3′)-IIa等耐藥基因都有被檢出，其中部分耐藥基因可通過質粒傳播，對公共衛(wèi)生安全具有潛在威脅。

2 沙門氏菌的耐藥現(xiàn)狀

沙門氏菌(Salmonella)屬于腸桿菌科，具有多種血清型。按生化反應本屬菌可分為4個亞屬：①亞屬Ⅰ是具典型生化反應的和最常見的沙門氏菌；②亞屬Ⅲ是亞利桑那沙門氏菌；③亞屬Ⅱ和Ⅳ是不具典型生化反應的沙門氏菌[16]。由于沙門氏菌有超過2 000種的血清型，對于沙門氏菌的防治較為復雜，每年沙門氏菌對養(yǎng)殖業(yè)造成的危害較大。據(jù)李晚霞等[17]研究，從四川邛崍、樂至、金堂、廣漢、新津、眉山和彭州等7個地區(qū)的養(yǎng)雞場可分離到沙門氏菌。楊丹等[18]對甘孜地區(qū)的藏雞源沙門氏菌的分離率為21.43%(42/196)，也同樣說明沙門氏菌在四川地區(qū)的分布非常廣泛。

沙門氏菌不僅是四川地區(qū)重要的動物源致病菌，也是食源性致病菌中重要的耐藥性監(jiān)測指標。從目前發(fā)表的論文來看，四川省不同年份不同株沙門氏菌的耐藥率具有明顯的差異。四川省沙門氏菌的耐藥狀況如表2所示，彭峻烽[19]從四川省肉鴨屠宰場分離得到156株沙門氏菌，其藥敏試驗結果顯示，分離菌株對萘啶酸的耐藥率最高，達到94.2%，對阿莫西林/克拉維酸和慶大霉素耐藥率最低，只有14.7%和14.1%。其多重耐藥性也相當嚴重，有63.5%的菌株對至少3種抗菌藥物耐藥。楊丹等[18]對藏雞沙門氏菌進行耐藥性分析，結果顯示沙門氏菌對阿莫西林的耐藥率超過90%，而對慶大霉素、氨芐西林的耐藥率較低，此外該論文中97.62%的沙門氏菌表現(xiàn)為對4種以上抗菌藥物耐藥的多重耐藥性。與之前的研究相比，Ma S等[20]研究結果的耐藥率普遍較低，這可能與采樣的隨機性有關。

表2 四川省沙門氏菌的耐藥率狀況

近年來，隨著沙門氏菌耐藥性的不斷增高，沙門氏菌已出現(xiàn)了由質粒介導的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因。有研究發(fā)現(xiàn)IncN質粒中攜帶有blaCTX-M-1耐藥基因[21]，并且IncI1質粒可以和IncN質粒共同參與blaCTX-M-1耐藥基因的轉移。盛煥精等[22]發(fā)現(xiàn)，IncI1質粒陽性菌株比IncN質粒陽性菌株的耐藥譜更寬，對頭孢類抗生素的耐受水平更高；IncN質粒陽性菌株對氨基糖苷類抗生素的抗性相對更高。YANG Y Q等[23]通過分析病雞中ESBLs陽性沙門氏菌中含有mcr-1和blaCTX-M-55基因的IncI2型接合質粒的全序列，發(fā)現(xiàn)mcr-1和blaCTX-M-55基因可共存于同一個質粒上，將該質粒提取出來，并對其基因文庫進行測序，發(fā)現(xiàn)該質粒具有包含mcr-1和tnpA基因的ISApl1轉座元件。Carroll L M等[24]在2019年首次報道了沙門氏菌中檢測到新耐藥基因mcr-9，發(fā)現(xiàn)mcr-9的基因序列與mcr-3和mcr-7最接近，但是卻對黏菌素不產(chǎn)生耐藥性，然而，將mcr-9導入大腸埃希氏菌DH5α后會對黏菌素產(chǎn)生耐藥性。楊丹等[18]檢測42株沙門氏菌的耐藥基因，其中blaTEM(β內(nèi)酰胺類)耐藥基因陽性率最高(90.48%)，其次是addA2(氨基糖苷類)和tet(A)(四環(huán)素類)耐藥基因，陽性率分別是85.71%和83.33%。Li R等[25]對四川省食品動物源(雞、豬和鴨)沙門氏菌的耐藥基因分析結果顯示，25株IntI1陽性沙門氏菌含有5組抗性基因，分別是dfrA12-aadA2、dfrA1-aadA1、dfrA1、blaPSE-1和dfrA1/aadA2。檢測出β內(nèi)酰胺酶基因分別為blaOXA-1、blaTEM-1、blaPSE-1和blaCMY-2，含β內(nèi)酰胺酶基因菌株均對氨芐西林耐藥，且blaCMY-2基因是國內(nèi)首次報告，這對國內(nèi)沙門氏菌病的治療和公共衛(wèi)生安全具有潛在影響。Ma S等[20]對四川省養(yǎng)殖場和屠宰場分離到的雞源沙門氏菌、豬源沙門氏菌進行耐藥基因分析顯示，28株氨基糖苷類耐藥菌株中，1株攜帶armA，27株攜帶rmtB，在70個氨芐西林耐藥菌株中有57個存在blaTEM-1，在36個第3代頭孢菌素耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)blaCTX-M-55、blaCTX-M-164、blaCTX-M-79、blaCTX-M-15、blaCTX-M-65和blaCTX-M-14，mcr-1存在于22株耐多黏菌素B菌株中，20株同時具有ESBLs基因。67株強力霉素耐藥菌株中分別檢測出tet(A)耐藥基因49株和tet(M)耐藥基因1株。馮蘭等[26]從四川紅原的牦牛糞便樣本中分離到16株ST71沙門氏菌，這些菌株對氨芐西林、頭孢噻呋、四環(huán)素和氯霉素的耐藥率全部為100%。綜上所述，四川省動物養(yǎng)殖中受沙門氏菌污染嚴重，且沙門氏菌攜帶多種重要耐藥基因，這些耐藥基因廣泛傳播并且可能存在人和動物之間的交叉?zhèn)鞑ィ瑢残l(wèi)生健康造成嚴重影響。

3 腸球菌的耐藥現(xiàn)狀

腸球菌屬(Enterococcus)包括糞腸球菌(E.faecalis)、屎腸球菌(E.faecium)、鳥腸球菌(E.avium)、耐久腸球菌(E.durans)、雞腸球菌(E.gallinarum)、酪黃腸球菌(E.casselipavus)和病臭腸球菌(E.malodoratus)等50多個種。腸球菌也被認為是世界范圍內(nèi)重要的臨床病原體，且越來越多的耐藥表型出現(xiàn)。在歐洲，9.8%的感染與腸球菌屬有關，其中10.2%的分離株對萬古霉素具有耐藥性[27]。而四川省2015年-2018年從無菌體液分離得到的腸球菌中有2.2%(40株)是萬古霉素耐藥菌株[28]。腸球菌是革蘭氏陽性菌的耐藥性水平指示菌，腸球菌耐藥性問題的日益嚴重，對全球范圍內(nèi)動物和人的健康具有潛在威脅。目前四川省對于人源腸球菌的報道較多，但是對于動物和食品源腸球菌的報道較少。目前已知的報道中，四川省動物源腸球菌感染豬較多，也有關于林麝等野生動物中分離腸球菌的報道。另外，郝中香等[29]從成都、雅安、平武和涼山地區(qū)的大熊貓繁殖基地中分離到11種腸球菌。

腸球菌產(chǎn)生耐藥性的機制有很多，而獲得性耐藥基因的傳播是腸球菌獲得耐藥性的重要途徑。張平等[30]從四川某規(guī)模豬場中分離到50株腸球菌，MIC測定結果顯示，50株菌的MIC50為32 μg/mL，MIC90為64 μg/mL，對于氟苯尼考的耐藥率為68%。50株分離菌僅檢測出fexA和fexB基因。該研究首次發(fā)現(xiàn)了325 bp的正向重復序列，由于其可形成環(huán)化結構的中間過渡態(tài)，從而以類似于質粒的方式在菌株間水平轉移，大大促進了fexA基因水平傳播的可能性。Yang J等[31]通過對尿液、分泌物和血樣本進行檢測，得到了43株耐萬古霉素腸球菌，其耐藥率為5.47%，并從中檢測到了vanR、vanS、vanH、vanA、vanX、vanY和vanZ耐藥基因。Kang Z Z等[32]從四川25個規(guī)模養(yǎng)豬場分離出的93株糞腸球菌和65株屎腸球菌進行研究，分別檢測到可轉移的噁唑烷酮耐藥基因cfr(0株)、optrA(6株)、poxtA(1株)。所有菌株對氯霉素、氟苯尼考和紅霉素耐藥，對氨芐西林、萬古霉素敏感，其中E.faecalisC25菌株含有2個optrA基因。張明國等[33]從198份健康奶牛糞便中分離到腸球菌105株，并做藥敏試驗，結果顯示所有分離腸球菌對多西環(huán)素和紅霉素耐藥率最高，分別是50%和42.3%，沒有分離到萬古霉素耐藥菌株。Cai J等[34]推測optrA突變、optrA的遺傳環(huán)境、細菌宿主和其他因素可能調節(jié)optrA的表達，并導致不同程度的利奈唑胺類耐藥。龔永平等[35]從四川省死亡林麝內(nèi)臟中分離出1株屎腸球菌LS170308，并對其分離菌做藥敏試驗，結果顯示屎腸球菌LS170308對四環(huán)素、慶大霉素、多西環(huán)素等13種藥物具有耐藥性，并發(fā)現(xiàn)該菌株攜帶PRI1和PRI4耐藥基因島。PRI1包括ant(9)、ermA和aac(6′)-le-aph(2″)-la耐藥基因，PRI4攜帶dfrG耐藥基因。綜上所述，四川省動物源腸球菌耐藥譜廣，耐藥基因復雜，多重耐藥性較嚴重。

4 展望

大腸埃希氏菌、沙門氏菌和腸球菌均為動物源以及食源性重要的致病菌，對人和動物的健康都有巨大的威脅。根據(jù)現(xiàn)有的論文總結來看，四川省大腸埃希氏菌、沙門氏菌和腸球菌的耐藥狀況嚴重，耐藥率普遍較高，對阿莫西林、四環(huán)素等一些常見抗生素耐藥性最為嚴重，多數(shù)菌株呈現(xiàn)多重耐藥性。此外，四川省大腸埃希氏菌、沙門氏菌和腸球菌攜帶多種對公共衛(wèi)生安全具有重要威脅的耐藥基因。四川省細菌耐藥問題不容小覷，當?shù)貞酱兖B(yǎng)殖場在臨床上規(guī)范使用抗生素，防止細菌耐藥情況進一步惡化，出現(xiàn)“超級細菌”。目前國家已經(jīng)開展了對動物源耐藥細菌的監(jiān)測，但省級層面監(jiān)測力量仍不足。建議省級層面應將研究工作落實到各個地(市)，并加強對大腸埃希氏菌、沙門氏菌和腸球菌耐藥性的篩查和檢測力度，深入研究其耐藥基因和耐藥表型。