翟軍軍，米耀云，李镕濤，馮 平，張 艷*

(1.榆林學(xué)院陜西省陜北絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西榆林 719000；2.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林 719000；3.榆陽(yáng)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西榆林 719000)

羔羊腹瀉一直是困擾陜北地區(qū)甚至全國(guó)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。隨著陜北地區(qū)養(yǎng)羊模式由天然放牧到集約化飼養(yǎng)轉(zhuǎn)變，養(yǎng)殖規(guī)模化程度越來(lái)越高，羔羊腹瀉在陜北地區(qū)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在產(chǎn)羔季節(jié)，如果飼養(yǎng)管理、產(chǎn)羔護(hù)理和疾病防控工作不到位，就可能引起羔羊大批發(fā)病[1]，給羊場(chǎng)或養(yǎng)羊戶造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了農(nóng)牧民脫貧致富的進(jìn)程，因此，羔羊腹瀉病越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

引起羔羊腹瀉的病原包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲等，最常見的細(xì)菌包括致病性大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)和沙門氏菌(Salmonella)等；病毒性病原包括牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)[2]、羊庫(kù)布病毒(Ovine Kobuvirus，OKoV)[3]、羊腸道病毒(Caprine enteroviruses，CEV)[4]、羊冠狀病毒(Coronavirus，CoVs)[5]、諾如病毒(Norovirus，NoV)[6]、羊札幌病毒(Sapovirus，SV)和輪狀病毒(Rotavirus，RV)[7]等；寄生蟲包括艾美耳球蟲(Eimeria)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)[7]等。

在養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)中，由于養(yǎng)殖戶的錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)，一旦發(fā)生腹瀉，就立即使用抗生素進(jìn)行治療，效果不佳后才會(huì)尋求專業(yè)人員幫助，該羊場(chǎng)也是如此，抗生素治療1周沒有效果，懷疑為其他類型病原感染所致。為了明確該羊場(chǎng)腹瀉的主要病原，結(jié)合該羊場(chǎng)實(shí)際情況，本研究擬采用PCR和飽和鹽水漂浮法對(duì)腹瀉樣品分別進(jìn)行病毒和寄生蟲檢測(cè)，以確定本場(chǎng)此次腹瀉的主要病因，為控制該羊場(chǎng)腹瀉提供技術(shù)指導(dǎo)，也為榆林市進(jìn)一步研究、防控陜北絨山羊腹瀉病提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 90份陜北絨山羊腹瀉樣品，其中2月齡～3月齡羔羊糞便樣品15份，6月齡～7月齡羔羊糞便樣品45份，成年羊糞便樣品30份，將樣品密封標(biāo)號(hào)，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑TaqPCR預(yù)混試劑Ⅱ，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；糞便RNA提取試劑盒，美國(guó)Omega公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 倒置相差顯微鏡(TS100-F)，蘇州景通儀器有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)(TDL-5A)，上海菲恰爾分析儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)碼顯微鏡(BA400)，麥克奧曲實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)(5424)、梯度PCR儀(6325)，Eppendorf公司產(chǎn)品；培養(yǎng)箱(HF90)，上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 參照文獻(xiàn)[8-14]BVDV、OKoV、CEV、CoVs、NoV、SV和RV基因設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA提取、RT-PCR鑒定 按照糞便RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取腹瀉樣本的RNA，然后按照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用上述引物進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，具體體系為：內(nèi)含2×DNA預(yù)混酶10 μL，β-actin上、下游引物各0.5 μL，病毒上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，水7 μL，總體積20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 3 min；95℃ 30 s，95℃ 30 s，退火按照表1中的溫度，30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 引物信息

1.2.3 糞便寄生蟲檢查 利用飽和食鹽水漂浮法分別對(duì)2月齡～3月齡、6月齡～7月齡和成年羊的新鮮糞便樣品進(jìn)行寄生蟲檢查，計(jì)算球蟲感染率。利用司陶爾蟲卵計(jì)數(shù)法分別對(duì)2月齡～3月齡、6月齡～7月齡和成年羊的新鮮糞便樣品進(jìn)行球蟲感染強(qiáng)度檢測(cè)，感染強(qiáng)度是指每克糞便樣品中所感染的球蟲卵囊總數(shù)。

1.2.4 卵囊的分離與培養(yǎng) 將糞便樣品放入100 mL燒杯中，加入1倍體積的蒸餾水?dāng)嚢钃v碎，再加入4倍體積的蒸餾水?dāng)嚢柽^(guò)濾；3 000 r/min離心10 min，棄上清液取沉淀，加入5倍體積的飽和食鹽水，混勻；3 000 r/min離心10 min，取上清液1/3～1/2于潔凈的燒杯中，加入5倍體積的蒸餾水，混勻；3 000 r/min離心10 min，沉淀即為羊球蟲卵囊，將其按照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行孢子化。

1.2.5 球蟲種類鑒定 參照文獻(xiàn)[16-18]對(duì)觀察到的卵囊進(jìn)行種類鑒定，觀察100個(gè)孢子化卵囊，記錄各種卵囊數(shù)量并計(jì)算各種卵囊所占的百分比。

2 結(jié)果

2.1 病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

病毒核酸檢測(cè)結(jié)果見圖1。利用BVDV、OKoV、CEV、CoVs、Norovirus、Sapovirus和RV特異性引物，并以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，BVDV、OKoV、CEV、CoVs、NoV、SV和RV核酸均為陰性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對(duì)照；2.牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒；3.羊庫(kù)布病毒；4.羊腸道病毒；5.冠狀病毒；6.諾如病毒；7.羊札幌病毒；8.輪狀病毒

2.2 球蟲感染率及感染強(qiáng)度

90份樣品糞便樣品只檢測(cè)到球蟲卵囊，其中2月齡～3月齡的感染率為100%(15/15)，6月齡～7月齡的感染率為95.6%(43/45)，成年羊的感染率為63.3%(19/30)，綜合感染率為85.6%(77/90)。司陶爾蟲卵計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果顯示，3個(gè)不同年齡段山羊球蟲的感染強(qiáng)大差異較大，其中2月齡～3月齡的感染強(qiáng)度為25 393 OPG，6月齡～7月齡的感染強(qiáng)度為2 800 OPG；成年羊的感染強(qiáng)度為1 200 OPG，該羊場(chǎng)陜北白絨山羊球蟲平均感染強(qiáng)度為9 798 OPG。

2.3 球蟲種類鑒定及各蟲種感染率

結(jié)果見表2。共檢出13種艾美耳球蟲，分別為約奇艾美耳球蟲(E.jolchijevi)、羊艾美耳球蟲(E.caprovina)、顆粒艾美耳球蟲(E.granulosa)、家山羊艾美耳球蟲(E.hirer)、阿沙塔艾美耳球蟲(E.ahsata)、阿氏艾美耳球蟲(E.arlongi)、山羊艾美耳球蟲(E.caprina)、克氏艾美耳球蟲(E.christenseni)、艾麗艾美耳球蟲(E.alijevi)、小型艾美耳球蟲(E.parva)、斑點(diǎn)艾美耳球蟲(E.puncatata)、錯(cuò)亂艾美耳球蟲(E.intricata)、柯氏艾美耳球蟲(E.kocharli)。2月齡～3月齡羔羊共發(fā)現(xiàn)13種球蟲，優(yōu)勢(shì)種為顆粒艾美耳球蟲(17%)和克氏艾美耳球蟲(18%)、6月齡～7月齡育成羊發(fā)現(xiàn)11種球蟲，優(yōu)勢(shì)種為山羊艾美耳球蟲(22%)和家山羊艾美耳球蟲(14%)、成年羊的10種球蟲，優(yōu)勢(shì)種為阿氏艾美耳球蟲(21%)、克氏艾美耳球蟲(17%)和顆粒艾美耳球蟲(17%)。

表2 不同年齡段絨山羊感染各類球蟲所占比例(n=100)

2.4 球蟲孢子化培養(yǎng)及生物學(xué)特征

本研究共檢出13種艾美耳球蟲，各種類球蟲卵囊孢子化的形態(tài)見圖2，現(xiàn)將優(yōu)勢(shì)種的卵囊形態(tài)描述如下。

A.約奇艾美耳球蟲；B.羊艾美耳球蟲；C.顆粒艾美耳球蟲；D.家山羊艾美耳球蟲；E.阿沙塔艾美耳球蟲；F.阿氏艾美耳球蟲；G.山羊艾美耳球蟲；H.克氏艾美耳球蟲；I.艾麗艾美耳球蟲；J.小型艾美耳球蟲；K.斑點(diǎn)艾美耳球蟲；L.錯(cuò)亂艾美耳球蟲；M.柯氏艾美耳球蟲

顆粒艾美耳球蟲(E.granulosa)的卵囊呈倒卵圓型，大小平均為33.25 μm×23.05 μm，形狀指數(shù)1.44，有極帽，有卵膜孔，無(wú)殘?bào)w，有斯氏體，孢子囊呈中型卵圓形，子孢子頭尾相鄰縱列于孢子囊中，孢子化時(shí)間60 h～72 h。

家山羊艾美耳球蟲(E.hirer)的卵囊呈橢圓形，大小平均為24.1 μm×18.5 μm，形狀指數(shù)1.30，有極帽，有卵膜孔，有極粒，有內(nèi)殘?bào)w，無(wú)外殘?bào)w，有斯氏體，孢子囊呈中型卵圓形，子孢子頭尾相鄰橫列于孢子囊中，孢子化時(shí)間36 h～60 h。

阿氏艾美耳球蟲(E.arlongi)的卵囊呈卵圓形，大小平均為30.2 μm×22.5 μm，形狀指數(shù)1.42，有極帽且極帽明顯，有卵膜孔，有內(nèi)殘?bào)w，有數(shù)個(gè)極粒，孢子囊呈中大型的長(zhǎng)卵圓形，子孢子呈魚形，頭尾并列，孢子化時(shí)間36 h。

山羊艾美耳球蟲(E.caprina)的卵囊呈長(zhǎng)橢圓形，大小平均為33.5 μm×23.9 μm，形狀指數(shù)1.40，無(wú)極帽，有卵膜孔，孔下有褶皺，有內(nèi)殘?bào)w，無(wú)外殘?bào)w，極粒數(shù)量多，孢子囊呈中型卵圓形，子孢子頭尾相鄰并列于孢子囊內(nèi)，孢子化時(shí)間72 h。

克氏艾美耳球蟲(E.christenseni)的卵囊呈卵圓形，大小平均為36.4 μm×24.4 μm，形狀指數(shù)1.49，有極帽和卵膜孔，有內(nèi)殘?bào)w，無(wú)外殘?bào)w，有極粒，孢子囊呈中型長(zhǎng)卵圓形，子孢子頭尾相鄰縱列于孢子囊中，孢子化時(shí)間72 h～96 h。

3 討論

感染性腹瀉是我國(guó)動(dòng)物傳染病中(尤其是幼齡動(dòng)物)發(fā)病率最高、流行最廣、危害性最大的一類疫病，該病多發(fā)生于飼養(yǎng)管理差、環(huán)境溫度驟變和突然更換飼料等情況下，臨床上細(xì)菌性腹瀉早已受到高度重視，但是病毒性腹瀉和寄生蟲性腹瀉往往被忽視。Dahmani H等[7]對(duì)來(lái)自阿爾及利亞中北部地區(qū)30個(gè)羊圈的559只新生羔羊的糞便樣本進(jìn)行病原特異性抗原ELISA檢測(cè)，小細(xì)小隱孢子蟲感染率為58.81%(312/559)、大腸埃希氏菌K99是27.72%(155/559)、輪狀病毒12.88%(72/559)和冠狀病毒3.57%(17/559)。Mi R等[19]對(duì)中國(guó)10個(gè)省份16個(gè)農(nóng)場(chǎng)的綿羊糞便樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隱孢子蟲總陽(yáng)性率為28.5%(295/1 035)，種類分布因省份和農(nóng)場(chǎng)而異，且在羔羊和成年綿羊中檢測(cè)到，斷奶后羔羊中感染率最高。Shabana I I等[20]對(duì)來(lái)自沙特阿拉伯麥地那地區(qū)腹瀉的綿羊和山羊調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大腸埃希氏菌的感染率分別為34.7%和30.7%。輪狀病毒的感染率分別為31.6%和27.4%，冠狀病毒的感染率分別為19.6%和16.2%。均為混合感染，輪狀病毒感染與產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)感染顯著相關(guān)。因此，在養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)中，為了科學(xué)合理的預(yù)防和治療腹瀉，避免盲目濫用抗生素，必須加強(qiáng)腹瀉病原，尤其是病毒和寄生蟲的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，腸道疾病會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，病死率增加、生長(zhǎng)抑制和轉(zhuǎn)化率降低。艾美耳球蟲引起的球蟲病是一種高發(fā)病率的寄生蟲病，且經(jīng)常是多種球蟲的混合感染，Trejo-Huitrón G等[21]對(duì)墨西哥東南部地區(qū)綿羊球蟲調(diào)查，共鑒定出11種艾美耳球蟲，而且約有80%羊?qū)儆诙喾N球蟲的混合感染，Al-Neama R T等[22]對(duì)英國(guó)西北部?jī)蓚€(gè)綿羊場(chǎng)連續(xù)跟蹤調(diào)查24個(gè)月，發(fā)現(xiàn)多數(shù)動(dòng)物至少感染10種不同艾美耳球蟲，其中巴庫(kù)艾美耳球蟲和卵形艾美耳球蟲最為常見，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)彎曲菌的感染與否能夠明顯影響艾美耳球蟲感染的強(qiáng)度。在本研究中，2月齡～3月齡羔羊共發(fā)現(xiàn)13種球蟲，6月齡～7月齡育成羊發(fā)現(xiàn)11種球蟲，成年羊發(fā)現(xiàn)10種球蟲，且也多為混合感染。

此外，de Macedo L O等[23]通過(guò)單因素分析和邏輯回歸評(píng)估危險(xiǎn)因素發(fā)現(xiàn)，山羊的球蟲感染與羊群規(guī)模、飼養(yǎng)方式、飼喂地點(diǎn)、飼糧中有無(wú)礦物鹽、牧場(chǎng)地形地貌和消毒周期等因素有關(guān)。對(duì)于綿羊而言，群體大小和飼養(yǎng)方式是影響球蟲感染最重要的因素，因此，在預(yù)防羊球蟲病時(shí)應(yīng)該充分考慮上述因素。