劉建奎，李 娜，吳熠丹，鄧小鶯，毛 婉，黃曉紫，張焦杰，黃夏玲，魏春華

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364000)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)根據(jù)其抗原性和基因組特性分為豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)和2016年新發(fā)的豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)3個(gè)型[1-4]。PCV1對(duì)豬無(wú)致病性，而PCV2是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)的主要病原，是當(dāng)今危害世界養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的病毒之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-8]。研究表明，PCV3在豬場(chǎng)普遍存在，可能與呼吸系統(tǒng)疾病和母豬繁殖障礙有關(guān)[3-4]。2019年，我國(guó)學(xué)者從臨床表現(xiàn)呼吸道疾病、腸道疾病和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)的豬中發(fā)現(xiàn)了一種新型的圓環(huán)病毒，命名為豬圓環(huán)病毒4型(PCV4)，引起了國(guó)內(nèi)學(xué)者的高度重視[9]。

PCV4基因組全長(zhǎng)為1 770 bp，包含2個(gè)主要開放閱讀框(ORF)，即ORF1和ORF2，分別編碼Rep蛋白和Cap蛋白。序列分析表明，PCV4與PCV1、PCV2及PCV3代表性毒株的核苷酸同源性僅為50%左右，而與水貂圓環(huán)病毒同源性較高，約為67%[9]。研究人員推測(cè)，PCV4可能與呼吸道癥狀、腸道癥狀及PDNS存在一定關(guān)聯(lián)[9-10]。福建省是我國(guó)養(yǎng)豬大省，為了解福建省規(guī)?；i場(chǎng)PCV4的感染和流行情況，本研究收集具有PMWS癥狀的發(fā)病豬組織病料或血清200份，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查及PCV4全基因組克隆，探求其分子流行特征，為該病毒的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2018年10月至2019年12月采集福建省龍巖市、漳州市、莆田市、泉州市等多個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)200份表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、皮膚蒼白或黃疸、呼吸急促等疑似PMWS發(fā)病豬的臨床樣品，包括脾臟和腎臟等病料和血清等，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將采集的組織病料和無(wú)菌PBS按1∶5比例充分研磨后反復(fù)凍融3次，4℃、10 000 r/min離心5 min，取上清，置-80℃保存?zhèn)溆?。血液樣?℃、4 000 r/min離心10 min，分離血清，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase，南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；pEASY-Blunt克隆載體，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，Takara公司產(chǎn)品；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 參照文獻(xiàn)[9]方法合成鑒定PCV4的熒光定量PCR檢測(cè)引物及探針和擴(kuò)增PCV4基因全長(zhǎng)的引物，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(CL31R)、梯度PCR儀(ProFlex)、熒光定量PCR儀(Stepone Plus)，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(GeL Doc TMXR)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-2C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 無(wú)菌采集發(fā)病豬的脾臟、淋巴結(jié)和腎臟等組織樣品和血清，按照Takara公司的DNA試劑盒說(shuō)明書提取DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCV4檢測(cè)及PCR擴(kuò)增 應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)提取樣品的DNA進(jìn)行PCV4檢測(cè)。將通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：ddH2O 7.0 μL，PCR buffer 12.5 μL，DNA 2.0 μL，10 mmol/L dNTP mixture 1 μL，上、下游引物各1.0 μL，酶 0.5 μL，總體系25 μL。PCR儀程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s,57℃ 45 s,72℃ 2 min,72℃ 10 min;35個(gè)循環(huán)。同時(shí)按照PCV2熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCV2檢測(cè)。

1.2.3 測(cè)序與分析 目的基因經(jīng)膠回收后連接至pMD19-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α中，將陽(yáng)性菌液送睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用Mega6.0和DNA Star軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。本研究序列比對(duì)所用的毒株信息見表1。

表1 本研究使用的毒株信息

2 結(jié)果

2.1 PCV4檢測(cè)結(jié)果

利用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)200份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明福建省豬場(chǎng)PCV2感染率為68%，而PCV4的感染率僅為2%(4/200)，PCV2和PCV4共感染率為1%(2/200)。為進(jìn)一步研究PCV4分子特征，對(duì)4份陽(yáng)性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明只有1份樣品為陽(yáng)性，擴(kuò)增后片段與目的片段大小一致，約為1 700 bp(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.FJ-PCV4；2.陰性對(duì)照

2.2 PCV4全基因組及ORF2序列分析

測(cè)序結(jié)果表明，F(xiàn)J-PCV4(登錄號(hào)：MT721742)的全基因組長(zhǎng)度為1 770 bp，與NCBI發(fā)表的PCV4參考毒株P(guān)CV-VIRES-NX01-G28、HNU-AHG1-2019的核苷酸同源性為98.8%～99.2%，與PCV2(PCV2a-PCV2e)代表毒株AF055392-PCV2a、AF055394、DK1980PMWSfree、BDH等同源性為50.7%～52.0%，與PCV3代表毒株MN2016和MO2015同源性為43.3%～43.4%，與PCV1代表毒株同源性為51.2%，而與水貂圓環(huán)病毒代表毒株Mink circovirus strain SD16、Mink circovirus strain MiCV-DL13同源性為68.1%～68.2%(圖2)。

圖2 FJ-PCV4全基因組與參考毒株核苷酸同源性比較

FJ-PCV4 ORF2基因全長(zhǎng)為687 bp，編碼228 aa，與GenBank發(fā)表的PCV4參考毒株P(guān)CV-VIRES-NX01-G28、HNU-AHG1-2019的核苷酸和氨基酸的同源性分別為90.0%～99.4%和98.7%～99.1%，與PCV2(PCV2a-PCV2e)代表毒株AF055392-PCV2a、AF055394、DK1980PMWSfree、BDH等核苷酸和氨基酸的同源性分別為49.1%～51.6%和43.8%～46.4%，與PCV3代表毒株MN2016和MO2015核苷酸和氨基酸的同源性分別為39.8%～40.0%和25.2%，與PCV1代表毒株核苷酸和氨基酸的同源性分別為為48.8%和43.5%，而與貂圓環(huán)病毒代表毒株Mink circovirus strain SD16、Mink circovirus strain MiCV-DL13核苷酸和氨基酸同源性分別為62.3%～62.6%和70.6%(圖3和圖4)。

圖3 FJ-PCV4 ORF2基因與參考毒株核苷酸同源性比較

圖4 FJ-PCV4 Cap蛋白與參考毒株氨基酸同源性比較

2.3 FJ-PCV4全基因組及ORF2遺傳進(jìn)化分析

為了研究PCV4毒株與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表毒株的遺傳特性和親緣關(guān)系，利用Mega6.0分子生物學(xué)分析軟件對(duì)PCV4毒株和已知的參考毒株繪制遺傳進(jìn)化樹。遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，F(xiàn)J-PCV4毒株與PCV-VIRES-NX01-G28、HNU-AHG1-2019親緣關(guān)系較為密切，處于同一進(jìn)化分支；FJ-PCV4、PCV-VIRES-NX01-G28及HNU-AHG1-2019毒株與水貂圓環(huán)病毒(Mink circovirus strain MiCV-DL13、Mink circovirus strain SD16)及蝙蝠相關(guān)的圓環(huán)病毒(Bat associated circovirus 1 isolate XOR)毒株親緣關(guān)系較近，處于同一大進(jìn)化分支。而FJ-PCV4毒株與PCV1、PCV2、PCV3參考毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處于不同進(jìn)化分支(圖5)。通過(guò)對(duì)PCV4Cap基因和參考毒株序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果與全基因組構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹結(jié)果相似(圖6)。

圖5 FJ-PCV4和參考毒株全基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖6 FJ-PCV4和參考毒株ORF2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

3 討論

豬圓環(huán)病毒(PCV)是單股環(huán)狀的DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是最小的動(dòng)物DNA病毒之一。已經(jīng)確定有3個(gè)基因型的PCV，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1對(duì)豬只無(wú)致病性，PCV2是豬圓環(huán)病毒相關(guān)病(PCVAD)的主要病原給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-8,11]，2016年出現(xiàn)了可能與PDNS和豬繁殖障礙等疾病相關(guān)新型豬圓環(huán)病毒PCV3，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前豬場(chǎng)感染PCV3也較為普遍[12-17]。2019年，我國(guó)學(xué)者從湖南省發(fā)病豬群第發(fā)現(xiàn)了新型豬圓環(huán)病毒(PCV4)，根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)命名原則，圓環(huán)病毒屬的成員在基因組核苷酸同源性應(yīng)在75%以上[18]。通過(guò)對(duì)PCV4的序列進(jìn)行分析表明PCV4與水貂圓環(huán)病毒的核苷酸序同源性最高(66.9%)，與其他PCV基因組的核苷酸同源性較低(43.2%～51.5%)， 因此PCV4為豬圓環(huán)病毒屬中的新成員[9]。

養(yǎng)豬業(yè)是福建省重要的經(jīng)濟(jì)支柱，為了解PCV4在福建省規(guī)?；i場(chǎng)的流行情況，本研究通過(guò)收集2018年-2019年豬場(chǎng)疑似PMWS的200份臨床樣本進(jìn)PCV4檢測(cè)，結(jié)果表明PCV4雖然已經(jīng)在福建省出現(xiàn)，但是豬場(chǎng)感染率很低，約為2%。此外，本研究通過(guò)臨床陽(yáng)性樣本，順利地?cái)U(kuò)增出1株P(guān)CV4全基因組序列。序列分析表明PCV4全基因組大小為1 770 bp，與參考毒株P(guān)CV-VIRES-NX01-G28、HNU-AHG1-2019的核苷酸序列同源性為98.8%～99.2%，與PCV1、PCV2及PCV3的代表毒株核苷酸序列的同源性僅為43.3%～52.0%，而與水貂圓環(huán)病毒(Mink circovirus strain MiCV-DL13、Mink circovirus strain SD16)及蝙蝠相關(guān)的圓環(huán)病毒(Bat associated circovirus 1 isolate XOR)核苷酸序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)其同源性高達(dá)65.2%～68.3%，與之前報(bào)道的結(jié)果相似[9]。全基因組和ORF2遺傳進(jìn)化樹表明PCV4與PCV1、PCV2以及PCV3代表毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與水貂圓環(huán)病毒(Mink circovirus strain MiCV-DL13、Mink circovirus strain SD16)及蝙蝠相關(guān)的圓環(huán)病毒(Bat associated circovirus 1 isolate XOR)毒株親緣關(guān)系較為密切，處于同一大進(jìn)化分支，進(jìn)一步證實(shí)PCV4為新型的圓環(huán)病毒。病毒株是否會(huì)對(duì)豬產(chǎn)生致病性需要進(jìn)一步研究。此外，本研究在200份疑似PMWS癥狀的豬組織病料和血清樣品中，PCV2檢出率為68%(136/200)，而PCV4的檢出率僅為2%(4/200)，2份陽(yáng)性病例為PCV2和PCV4共感染，表明 PCV4可能引起PMWS和PDNS，這需要通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步深入研究[9-10]。

綜上所述，雖然目前在福建省豬場(chǎng)內(nèi)PCV4的感染率比較低，但應(yīng)該對(duì)PCV4的流行動(dòng)態(tài)進(jìn)行嚴(yán)密的監(jiān)視，做出相應(yīng)的防控措施。