范清濤，鄧建朝，張賓，陳勝軍*，楊賢慶，李春生，潘創(chuàng)，王迪

1(浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山，316022)2(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州，510300)

呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)是一種人工化學(xué)合成的廣譜抗生素，具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生抗藥性且低成本的特點，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]。氨基脲(semicarbazide，SEM)，被認(rèn)為是抗生素呋喃西林藥物的特征性代謝物[2]。NFZ原藥及其代謝殘留物存在致癌、致突變、致畸的風(fēng)險。美國、歐盟、日本及中國先后規(guī)定禁止在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用NFZ藥物。NFZ原藥在動物體內(nèi)的半衰期短，代謝迅速，原藥本身難以被檢測，而SEM能與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的殘留物質(zhì)，可在體內(nèi)存在幾個星期。因此，在水產(chǎn)品風(fēng)險監(jiān)測和監(jiān)督抽查中，以殘留物SEM的檢測值來判斷養(yǎng)殖中是否非法使用NFZ。我國對動物源性食品中SEM殘留的限量要求為1.0 μg/kg[3]。

目前，NFZ代謝物一般采用毛細(xì)管色譜分析方法[4]、免疫層析法[5-6]、生物傳感器法[7]、高效液相色譜法[8-9]和液質(zhì)聯(lián)用法[10-13]檢測，這些檢測方法多應(yīng)用在可食部分[14]，蝦殼中殘留分析方法報道較少[15]。近些年來，甲殼類水產(chǎn)品抽檢結(jié)果表明SEM超標(biāo)現(xiàn)象較嚴(yán)重，導(dǎo)致水產(chǎn)品的質(zhì)量備受質(zhì)疑，也對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成負(fù)面影響。有研究表明甲殼類水產(chǎn)品中存在內(nèi)源性SEM，且可能來源于甲殼。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[10]顯示SEM衍生的方式為恒溫振蕩，衍生時間16 h。微波技術(shù)已在樣品提取、消解、有機(jī)合成和衍生等諸多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。微波提取不僅具有低耗能、耗時短等優(yōu)點，同時還具有高效率，易操作等優(yōu)勢，微波輔助提取技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于衍生提取工藝中[16]。因此，本文將微波技術(shù)運(yùn)用于輔助SEM衍生[17-18]，針對蝦類肌肉和殼2個部位進(jìn)行SEM檢測方法的優(yōu)化，以期實現(xiàn)快速衍生目的，提高樣品檢測效率。與恒溫振蕩方式對比，本方法衍生時間縮短，方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于甲殼類水產(chǎn)品中NFZ代謝物殘留測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SEM標(biāo)準(zhǔn)品及SEM內(nèi)標(biāo)(SEM·HCl -13C-15N2)，美國Sigma-Aldrich公司；乙腈(質(zhì)譜純)、2-硝基苯甲醛(色譜純)，美國Thermo Fisher公司；實驗用水為超純水；鹽酸、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亞砜、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉(均為分析純)，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ-S-Micro超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司；MAS-Ⅱ常壓微波輔助合成萃取儀，上海新儀器微波化學(xué)科技有限公司；TDZ5-WS離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Sigma 3k30高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；IKA T50均質(zhì)機(jī)，德國IKA公司；AS20500/BDT超聲清洗機(jī)，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Sartorius BS3223S電子分析天平，德國Sartorius公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；渦旋混合器，美國Henry Troemner公司。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜條件

進(jìn)樣量：5.0 μL，柱溫：30 ℃，色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)反相色譜柱，流速：0.30 mL/min。流動相：A相為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水(色譜純)溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Program of gradient elution

1.3.2 SEM及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離正離子(electrospray ionization positive ion，ESI+)模式掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple-reaction monitoring，MRM)模式。離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；脫溶劑氣體溫度：600 ℃；脫溶劑氣體流量：1 000 L/h，錐孔氣體流量：50 L/h。母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量如表2所示。

表2 NFZ代謝物及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件Table 2 NFZ metabolites and their internal target mass spectrometry conditions

1.4 樣品采集

羅氏沼蝦樣品采自珠海養(yǎng)殖基地，用便攜冰箱運(yùn)回實驗室，在廣州華潤萬家超市、水產(chǎn)市場購買斑節(jié)對蝦、南美白對蝦、羅氏沼蝦3種蝦類樣品，-20 ℃冷凍保存待測。檢測分析前，將樣品解凍至室溫，將樣品分為蝦肉和去頭蝦殼。蝦殼70 ℃溫度條件下烘干24 h，再用粉碎機(jī)粉碎。

1.5 樣品前處理

1.5.1 蝦肉預(yù)處理

振蕩預(yù)處理：參考農(nóng)業(yè)部783號公告-1—2006，優(yōu)化后使用。稱取均質(zhì)蝦肉樣品2 g于50 mL離心管中，加入0.2 mol/L鹽酸5 mL，100 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液200 μL，渦旋混勻5 min，離心管置于37 ℃恒溫水浴振蕩器、200 r/min避光振蕩16 h。

超聲預(yù)處理：稱取均質(zhì)蝦肉樣品2 g于50 mL離心管中，加入0.2 mol/L鹽酸5 mL，100 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液200 μL，渦旋混勻5 min，置于40 ℃超聲波清洗機(jī)中超聲。

微波預(yù)處理：稱取均質(zhì)蝦肉樣品2 g于50 mL離心管中，加入0.2 mol/L鹽酸5 mL，100 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液200 μL，渦旋混勻5 min，置于400 W微波。

取出衍生化樣品冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)入50 mL離心管，加入磷酸氫二鉀溶液2.0～4.0 mL混勻，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，加入5 mL乙酸乙酯，渦旋15 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)乙酸乙酯提取操作1次，合并上清液于10 mL離心管，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑瑲堅?.5 mL乙腈-甲酸水溶液[V(乙腈)∶V(0.1%甲酸)=5∶95]，加入1.5 mL正己烷，渦旋8 min，12 000 r/min離心10 min，過0.22 μm濾膜，待測。

1.5.2 蝦殼預(yù)處理

參考曹愛玲等[19]方法優(yōu)化后使用。蝦殼在70 ℃熱風(fēng)干燥箱烘適量時間，然后用粉碎機(jī)粉碎，稱取烘干粉碎的蝦殼2.00 g于50 mL離心管中，依次加入0.4 mol/L鹽酸5 mL、100 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液100 μL、0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液200 μL，渦旋混勻5 min，最后置于37 ℃恒溫水浴振蕩器200 r/min避光振蕩16 h，后面與1.5.1蝦肉處理方法相同。

1.6 SEM標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

100 μg/mL SEM標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取5.0 mg SEM，用甲醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，于0～4 ℃避光存放。

SEM標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取適量SEM標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈稀釋，配制濃度為10和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

分別準(zhǔn)確移取10 ng/mL SEM標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100、200、500 μL,100 ng/mL SEM標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100、200、500和1 000 μL于7個50 mL離心管中，按1.5步驟操作，按1.3條件檢測。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)采用Origin和Microsoft Excel 2016處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

不同型號的儀器在液相色譜質(zhì)譜最佳方法參數(shù)方面都會有所差別，本方法采用Waters TQ-S Micro液質(zhì)聯(lián)用，取1 mL 1 μg/mL的SEM標(biāo)準(zhǔn)工作液，和1 mL 1 μg/mL的SEM內(nèi)標(biāo)工作液，按照1.5的方法定容于2 mL樣品瓶中。分別吸取300～500 μL樣品于毛細(xì)管注射器，以流動注射的方式，在ESI+模式下，選定已知目標(biāo)物的母離子，進(jìn)行離子源參數(shù)優(yōu)化；而后分別以二級質(zhì)譜方式進(jìn)行其子離子及碰撞能量優(yōu)化。采用ACQUITY UPLC?BEH C18反相色譜柱對流動相洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的洗脫條件詳見1.3.1。優(yōu)化后的質(zhì)譜方法詳見1.3.2。該方法的總離子流圖如圖1所示。

圖1 SEM及其內(nèi)標(biāo)總離子流圖Fig.1 SEM and its internal standard total ion flow diagram

如圖1所示，優(yōu)化后的方法樣品SEM出峰時間在1.14 min，峰形良好，在受到蝦殼、肌肉樣品中其他基質(zhì)的影響下，仍能準(zhǔn)確地檢測到SEM，具有較強(qiáng)的抗干擾性。在肌肉樣品SEM含量很低的情況下，仍能保持良好峰形，表明方法靈敏度高。單個樣品檢測時長為6 min，在穩(wěn)定檢測SEM的同時，大大縮短了檢測時間，適用于現(xiàn)代水產(chǎn)品安全質(zhì)量的監(jiān)測。

2.2 樣品前處理中鹽酸用量的優(yōu)化

前處理方法主要利用在酸性環(huán)境下將SEM從蛋白質(zhì)上解離后衍生，提取濃縮的原理。本研究將蝦類分為肌肉、蝦殼兩部分，由于蝦殼與肌肉組織成分不同，主要由幾丁聚糖和CaCO3組成，其中CaCO3含量很高，在解離衍生的同時會消耗酸，使其無法維持在穩(wěn)定的酸性環(huán)境下衍生，導(dǎo)致SEM無法衍生完全。上機(jī)檢測結(jié)果會出現(xiàn)內(nèi)標(biāo)工作溶液相應(yīng)不穩(wěn)定或偏低現(xiàn)象，導(dǎo)致SEM含量偏低或未檢出。經(jīng)優(yōu)化及對比實驗，優(yōu)化添加鹽酸濃度及體積見表3。

表3 鹽酸添加濃度和體積Table 3 The added concentration and volume of hydrochloric acid in the sample

由表3可知，2 g肌肉、蝦殼樣品添加鹽酸，肌肉經(jīng)過16 h衍生后，pH均保持在2.57以下，說明其解離衍生反應(yīng)在穩(wěn)定的酸性條件下進(jìn)行，保證了SEM充分衍生。蝦殼在添加5 mL和肌肉相同濃度的鹽酸后，pH在7以上，因此增加鹽酸濃度進(jìn)行實驗，在加入5 mL 0.4 mol/L 鹽酸時，肌肉樣品的pH達(dá)到3.48。結(jié)果表明，2 g蝦肉在加入5 mL 0.2 mol/L鹽酸，2 g蝦殼在加入5 mL 0.4 mol/L鹽酸時，樣品pH達(dá)到在穩(wěn)定酸性條件下衍生的要求，此時鹽酸用量，為最佳條件。

2.3 衍生方式的優(yōu)化

本實驗對比了水浴振蕩、超聲波輔助衍生和微波輔助衍生3種方式對衍生效果的影響，結(jié)果列于表4。由表4可以看出，這3種方法對衍生效果具有顯著性差異。超聲波高頻率振蕩，可加速樣品分散，增大樣品與溶劑的接觸面積，提高傳質(zhì)速度，從而縮短衍生反應(yīng)的時間。按照1.5方法進(jìn)行超聲操作，在常溫下分別衍生30、60和90 min。結(jié)果表明，超聲30 min時，衍生不完全；超聲90 min，衍生物峰面積達(dá)到最大，但是弱于振蕩12 h的效果。按照李劍等[20]的方法，設(shè)定微波提取溫度為60 ℃，分別微波衍生10、20和30 min。結(jié)果表明，微波10 min時，衍生不完全；微波超過20 min，衍生物峰面積增加不顯著，微波衍生30 min和振蕩衍生16 h沒有顯著差異，均能滿足痕量分析要求。

表4 微波輔助、超聲波和恒溫振蕩衍生方法的對比(n=3)表4 Comparison of the derivative methods of microwave-assisted and constant temperature (n=3)

2.4 方法的適用性評價

2.4.1 方法的線性范圍與檢測限

按1.6中的方法配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜測定，以SEM濃度為橫坐標(biāo)，SEM峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(圖2)。

圖2 SEM標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 SEM standard curve

結(jié)果表明，SEM濃度越高，響應(yīng)越高，回歸方程為y=0.200 6x+0.055 9，R2=0.999 7，SEM濃度在0.5～100 μg/L與其峰面積比值呈良好的線性關(guān)系。該方法的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為 0.5 μg/kg(S/N≥10)，可以對SEM進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析，滿足現(xiàn)行限量標(biāo)準(zhǔn)下的檢測要求。

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

為考察優(yōu)化后的方法對蝦體中SEM測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，選擇蝦肉和蝦殼樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加實驗，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度的測定。根據(jù)SEM在不同組織中本底含量，其添加水平為1.0～20.0 μg/kg，每個添加水平做3個平行樣品，通過回收率和精密度評價方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性和適用性，結(jié)果見表5。

由表5可知，蝦肉和蝦殼中SEM的平均回收率為91.4%～103.6%；精密度為3.06%～6.56%。以上研究結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性均良好，能夠滿足蝦肉和蝦殼中SEM分析的要求。

表5 樣品中SEM的加標(biāo)回收率和精密度Table 5 Standard recovery and precision of SEM in samples

2.5 實際樣品測定

采用本方法對市場上采集的斑節(jié)對蝦、南美白對蝦和羅氏沼蝦3種養(yǎng)殖蝦類，每種蝦類20份樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，斑節(jié)對蝦蝦肉中SEM含量為未檢出～0.76 μg/kg，南美白對蝦蝦肉中SEM含量為未檢出～0.33 μg/kg，羅氏沼蝦蝦肉中SEM含量為0.71～2.72 μg/kg。斑節(jié)對蝦蝦殼中SEM含量為3.04～15.36 μg/kg，南美白對蝦蝦殼中SEM含量為2.42～10.27 μg/kg，羅氏沼蝦蝦殼中SEM含量為26.38～64.16 μg/kg。3種蝦類樣品的總離子流圖如圖3所示，蝦類樣品中SEM含量高低不同，均能呈現(xiàn)良好的峰形圖，在樣品基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾下仍能準(zhǔn)確檢測出SEM，從峰形、響應(yīng)值可以初步判斷出樣品SEM含量的高低。結(jié)果表明，斑節(jié)對蝦、南美白對蝦和羅氏沼蝦蝦肉中能夠檢出NFZ代謝物SEM，并且蝦殼中SEM含量遠(yuǎn)高于蝦肉，該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性強(qiáng)，適用于蝦類樣品中NFZ代謝物殘留的實際監(jiān)測。

a-斑節(jié)對蝦蝦殼；b-斑節(jié)對蝦蝦肉；c-南美白對蝦蝦殼；d-南美白對蝦蝦肉；e-羅氏沼蝦蝦殼；f-羅氏沼蝦蝦肉圖3 蝦類樣品的MRM圖譜Fig.3 MRM chromatograms in shrimp

3 結(jié)論

本研究在農(nóng)業(yè)部783號公告-1—2006方法基礎(chǔ)上，根據(jù)蝦類不同部位進(jìn)行樣品前處理優(yōu)化，建立了微波輔助衍生超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定NFZ代謝物的檢測方法。在樣品提取中，采用微波波輔助衍生方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的恒溫振蕩法，并在此基礎(chǔ)上探討了微波輔助衍生的時間，發(fā)現(xiàn)微波溫度為60 ℃衍生時間為30 min時衍生效率達(dá)到最佳。鹽酸在代謝物衍生過程中具有重要作用，添加0.4 mol/L鹽酸5 mL，能夠保障蝦殼中NFZ代謝物完全衍生。SEM在0.5～100 μg/L 線性關(guān)系良好，相對回收率為91.4%～103.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.06%～6.56%，檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。該方法檢測時間短，簡便、可靠，準(zhǔn)確度和精密度符合殘留分析要求，能滿足市場上養(yǎng)殖蝦類中NFZ藥物的檢測監(jiān)控要求，為相關(guān)部門的監(jiān)督檢測提供新的方法參考。