曹慶龍，雷橋，2，3*，吳浩，高文婧

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)3(農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306)

抗菌活性包裝是近年來功能性包裝的研究熱點之一，其主要實現途徑包括負載活性物質的微囊、復合膜、涂膜、靜電紡絲等[1-4]。其中對活性物質的裝載量及緩釋性能是需要重點解決的問題。氣凝膠作為一種新型功能材料，其優(yōu)良的孔隙率與比表面積為其在食品、醫(yī)藥、生物科學、隔音隔熱、吸附等領域提供了結構支持[5-8]。研究表明，氣凝膠的三維孔洞結構可以裝載活性物質并起到緩釋的作用，有望解決上述包裝關鍵問題[9-11]。

目前對于氣凝膠的研究大多集中于硅類氣凝膠，相對于這種無機類氣凝膠，多糖/蛋白類氣凝膠則表現出更好的生物相容性與生物可降解性[12]。DHARUNYA等[13]以姜黃素作為交聯(lián)劑，交聯(lián)膠原蛋白制備的氣凝膠可以用于人工骨架。ANJA等[14]發(fā)明了一種可生物降解的有機氣凝膠，可作為腸外給藥的診斷劑和治療劑。但總的來說，多糖/蛋白類氣凝膠裝載和緩釋活性物質方面的研究仍較少。

在活性包裝應用中，精油為抗菌劑之一有著較為廣泛的應用。丁香精油的主要成分是丁香酚，除了具有較強的殺菌能力之外，對流感病毒也有一定的抑制作用，可入藥，用于降血壓，作為局部鎮(zhèn)痛藥用于齲齒等[15-16]。本研究選用丁香精油作為包裝活性物質。

本研究的前期工作對普魯蘭多糖(pullulan，PUL)氣凝膠的制備工藝進行了優(yōu)化并探討了其應用可行性[17]。亦有學者探討了乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)氣凝膠的機械性能與應用性[18-20]。由于多糖類PUL氣凝膠吸濕性高、受壓易變形，而蛋白類WPI氣凝膠質地則較脆，結構易崩塌，若將二者復合則可能改良性能。為此，本文在前期單因素實驗基礎上進行Plackett-Burman 設計，選出3個最顯著因素：PUL添加量、pH與凝膠溫度，并以此進行二次回歸實驗。采用 Box-Behnken 模型，設置3因素3水平，以氣凝膠的丁香精油裝載性能為響應值進行優(yōu)化并對其吸濕性、抗壓性能、熱力學性能、微觀結構及精油釋放性能進行測試，旨在為活性包裝研究提供一種新的途徑，為多糖/蛋白類氣凝膠在裝載緩釋領域的應用提供可行方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

乳清分離蛋白，美國ISOPURE公司；普魯蘭多糖(純度>98%，Mw:342～710 000)，上海薩恩化學技術有限公司；丁香精油，吉安市中香天然植物有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、溴化鉀，國藥集團上海化學試劑有限公司；去離子水，實驗室提供。以上試劑除注明外均為分析純。

1.2 儀器與設備

TA.XT Plus質構儀，英國SMS公司；S3400 N型掃描電子顯微鏡，Hitachi(日立)公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省鞏義市科瑞儀器有限公司；SCIENTZ-10 N型真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet iZ10型傅立葉變換顯微紅外成像光譜儀，Thermo Scientific有限公司；LHS-500HC-II型恒溫恒濕箱、YP202 N型電子天平、雷磁PHS-3C pH計，上海精密科學有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 WPI-PUL復合氣凝膠的制備

用電子天平稱取20 g WPI粉末置于潔凈燒杯中，添加一定量PUL粉末，各加100 mL去離子水在25 ℃水浴條件下充分攪拌使之混合。肉眼不可見白色懸浮物后再繼續(xù)攪拌5 min?；靹蚝竺芊?，于4 ℃冰箱靜置12 h,使其充分水合。后加入0.585 g NaCl，并用1 mol/L的HCl或NaOH溶液調節(jié)其溶液pH，于25 ℃恒溫水浴攪拌30 min。將攪拌后分散均勻的懸浮液除去溶液上層泡沫后倒入2 mL離心管，一定溫度條件下水浴加熱30 min,使之充分形成WPI-PUL水凝膠，再置于-20 ℃冰箱冷凍12 h。將冷凍完全的樣品置于真空冷凍干燥機進行干燥(規(guī)程：-45 ℃，15 Pa，2 d)，制得WPI-PUL復合氣凝膠。制備完成的樣品氣凝膠測定其丁香精油裝載率，并以此為響應值，采用 Design-Expert軟件進行響應面實驗設計和分析結果得出優(yōu)化方案并驗證。精油釋放性能、抗壓性能等性能測試均基于此最優(yōu)方案進行。

1.3.2 精油裝載

采用AHMADI等[18]的方法并作修改，將WPI-PUL復合氣凝膠樣品浸入丁香精油中，在30 ℃恒溫密封條件下浸載3 h，充分吸附精油至氣凝膠的孔道中。后取出置于敞開培養(yǎng)皿上，30 ℃恒溫使其充分揮發(fā)至恒重。裝載率按公式(1)計算：

(1)

式中：T代表裝載率，%；m0代表未浸精油前氣凝膠的初始質量，g；mt代表揮發(fā)至恒重的氣凝膠質量，g。

1.3.3 精油釋放

根據國標GB 31604.1—2015，以95%(體積分數，下同)乙醇溶液和蒸餾水作為食品模擬液。將載有精油的WPI-PUL復合氣凝膠樣品分別完全浸入50 mL 95%乙醇溶液和蒸餾水中，25 ℃水浴條件下密封磁力攪拌，每隔10 min取樣3 mL溶液，并補充3 mL 對應溶劑。對取出液進行紫外分光光度檢測，對照組為同等處理的未載油氣凝膠樣品浸泡液，通過標準曲線計算精油釋放濃度[21]。釋放率R按公式(2)計算：

(2)

式中：R代表釋放率，%；Ci代表第i次取樣時精油濃度，g/mL；m代表精油裝載量，g。

1.3.4 吸濕率測定

采用SU等[22]的方法并作修改,將氣凝膠置于相對濕度為83.6%，溫度為30 ℃的恒溫恒濕箱中，每隔一定時間稱取一次氣凝膠重量，直至氣凝膠重量恒定。氣凝膠吸濕率按公式(3)計算:

(3)

式中：H代表吸濕率，%；W代表吸濕一定時間后氣凝膠的質量，g；W0代表未吸濕前氣凝膠的初始質量，g。

1.3.5 抗壓性能測試

將裝載精油前后的WPI-PUL復合氣凝膠切成高度為1 cm的圓柱狀樣品。參數設定如下，探頭：36R平面探頭；測前速度：1.0 mm/s；測定速度：0.1 mm/s；測后速度：1.0 mm/s；應變：75%。在獲取的應力-應變曲線上，取應變范圍8%～15%線性區(qū)域的斜率，記作氣凝膠的壓縮模量[18]。

1.3.6 掃描電鏡分析

分別將裝載前后的WPI-PUL復合氣凝膠樣品沿橫切面切成1 mm厚的薄片，粘于導電膠上噴金120 s后，使用掃描電鏡觀察氣凝膠表面的微觀結構[23]。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析

分別將各組樣品碾碎后，與KBr混合。混合比例為1∶100(質量比)。再進行研磨，壓片。傅里葉紅外光譜的掃描范圍為450～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.8 熱重分析(thermogravimetric analysis,TG)

分別將各組樣品(5～10 mg)置于Al2O3坩堝中，以20 mL/min流速的氮氣作為保護氣和吹掃氣，以10 ℃/min的加熱速率從30 ℃加熱到600 ℃[24]。

1.3.9 數據統(tǒng)計與分析

文中數據均為3次平行實驗平均值，采用SPSS 25軟件進行數據處理與分析并用Orgin 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 響應面設計與結果分析

采用 Box-Behnken 模型，以PUL添加量(A)、凝膠溫度(B)與pH(C)為考察因素，設置3因素3水平，以氣凝膠的丁香精油裝載性能為響應值進行實驗。實驗設計及水平選擇見表1,實驗結果見表2。

表1 WPI-PUL復合氣凝膠響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of WPI-PUL composite aerogel response surface experiments

表2 Box-Behnken 實驗設計及其結果Table 2 Design and results of Box-Behnken

對表2數據進行多元回歸擬合，得到方程如下：

Y=7.336 00-0.582 70A+5.231 80B+10.915 50C+0.013 100AB+0.017 833AC+0.062 500BC-5.914 44E-003A2-0.038 230B2-1.105 75C2

式中，Y為復合氣凝膠的丁香精油預測裝載率，%；A為PUL添加量，mg/mL；B，pH；C為凝膠溫度，℃。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

3種顯著影響因素(PUL添加量、pH、凝膠溫度)的響應面和等高線如圖1所示。響應面皆呈開口向下的凸面，說明存在響應最大值[25]。響應面的陡緩程度和等高線的形狀反應了因素交互作用的強弱。響應面走勢陡表明影響顯著，反之則說明影響不明顯。等高線近橢圓則表明兩因素之間交互作用顯著；近圓則說明交互作用不顯著[26]。結果表明,PUL添加量(A)和pH(B)交互作用對響應面值的影響顯著，PUL添加量(A)和凝膠溫度(C)、pH(B)和凝膠溫度(C)交互作用對響應值的影響不顯著。

a-pH、PUL添加量；b-凝膠溫度、PUL添加量；c-凝膠溫度、pH圖1 PUL添加量、pH、凝膠溫度交互作用對丁香精油裝載率的響應面曲線及等高線Fig.1 Response surface curves and contour lines of clove essential oil loading rate by interaction of PUL addition, pH and gel temperature

根據Design-Expert軟件分析，得到丁香精油最大裝載率的理論最佳條件為：PUL添加量為55.86 mg/mL, pH值7.87，凝膠溫度83.85 ℃。該條件下預計得到的復合氣凝膠丁香精油裝載率為254.113%。考慮到實際操作，取PUL添加量55 mg/mL, pH值7.9，凝膠溫度84 ℃，實際丁香精油裝載率為254.23%，與預測值非常接近，說明擬合結果可以真實地反映各因素對復合氣凝膠丁香精油裝載率的影響，具有實際應用價值。

2.2 精油釋放性能分析

圖2為裝載丁香精油的WPI-PUL復合氣凝膠在蒸餾水及95%乙醇中的動態(tài)釋放曲線，曲線的斜率均隨時間遞減，表明其釋放速率隨浸漬時間的延長而放緩，前10 min表現出最大釋放速率。在水體系中140 min 后釋放速率放緩，并在360 min后趨于平衡，釋放率為48.94%；95%乙醇體系中，180 min后釋放速率放緩，并在420 min后趨于平衡，釋放率為65.59%。記平衡數值為總釋放率，平衡數值對應時間越大，則說明復合氣凝膠的緩釋性能最好，從中可以看出在95%乙醇體系中裝載丁香精油的復合氣凝膠緩釋性能更好。2種體系釋放總體趨勢相似，但總釋放量均有所增大，這是由于丁香精油在乙醇中具有更大的溶解度。擬合各釋放曲線得到的模擬方程如表4所示。

圖2 復合氣凝膠精油釋放曲線Fig.2 Essential oil release curve of composite aerogels

表4 氣凝膠精油釋放率的非線性模擬方程Table 4 Simulation equation of aerogel essential oil release curve

2.3 吸濕性能分析

氣凝膠產品本身含水量很低，因為在冷凍干燥過程中大部分的水分已被除去。由于氣凝膠本身的多孔洞結構具有一定的吸水性，而吸水之后的氣凝膠不易保存，更容易腐敗變質，對于裝載活性藥物的適用性也大大降低[20]。圖3為復合氣凝膠的吸濕率隨時間的變化曲線，曲線的斜率即為吸濕速率。復合氣凝膠在前6 h表現出較大的吸濕速率，隨后吸濕速率放緩，并于24 h后達到動態(tài)平衡，最終平衡吸濕率為11.41%。

2.4 抗壓性能分析

圖4反映了抗壓測試過程中復合氣凝膠在勻速形變過程中應力的變化情況。未裝載精油的氣凝膠樣品曲線前18%區(qū)域(以橫坐標應變衡量，下同)近似為一條直線，取8%～15%區(qū)域的斜率記作復合氣凝膠的壓縮模量衡量其抗壓性能，其值越大說明抗壓性能越好，未裝載精油的氣凝膠壓縮模量為21.745 MPa，具有良好的抗壓性能。壓縮形變45%～50%后應力大幅減小，這是因為壓縮過程中氣凝膠部分結構坍塌導致應力變小。壓縮形變50%后應力顯著增大，這可能是因為氣凝膠孔道接近完全壓縮，結構難以改變所致。裝載丁香精油后復合氣凝膠的壓縮模量有所下降，這可能是由于干燥除去復合氣凝膠表面多余精油時，其結構產生輕微崩塌，但其抗壓性能(11.247 MPa)仍能滿足正常應用需求。

圖4 氣凝膠裝載精油前后的應變-應力曲線Fig.4 Strain-stress curves of aerogels before and after loading essential oils

2.5 掃描電鏡分析

復合氣凝膠裝載丁香精油前后的微觀結構如圖5所示。

a-未裝載丁香精油；b-裝載丁香精油圖5 氣凝膠裝載精油前后的微觀結構Fig.5 Microstructure of aerogels before and after loading essential oils

圖5-a為復合氣凝膠未裝載丁香精油的微觀結構圖?？椎婪植驾^為均一，孔徑分布納米級到微米級，反映出在響應面優(yōu)化條件下制備的復合氣凝膠仍有較好的開孔情況。圖5-b為復合氣凝膠裝載丁香精油的微觀結構圖，可以看出，精油被均勻地吸附入凝膠孔道中，孔道結構依然存在并未被精油破壞。實驗發(fā)現，吸附并不僅僅存在于氣凝膠表面，復合氣凝膠中心部分仍有較多精油被吸附?？讖皆叫?，吸附作用越好，這與毛細管吸附作用類似。

2.6 傅里葉紅外分析

圖6為復合氣凝膠及其裝載丁香精油前后的傅里葉紅外波譜。1 025 cm-1處附近為PUL中醚鍵的伸縮振動，而1 657 cm-1處附近則是WPI的特征峰，為C—N 的伸縮振動。相對于空白組，裝載丁香精油組在1 605 cm-1、1 516 cm-1、1 458 cm-1處出現了3個吸收峰，這為丁香酚苯環(huán)的特征峰，3 015 cm-1處為苯環(huán)上C—H的伸縮振動。添加了丁香精油后對復合氣凝膠的紅外光譜總體影響不大，主要因為WPI、PUL與丁香酚有相似的官能團。空白組3 293 cm-1處出現一較寬吸收峰，為分子間O—H的伸縮振動，裝載精油后該峰強度均有所變化，并發(fā)生了不同程度的偏移，說明體系有新的氫鍵形成，反映出精油吸附到復合氣凝膠孔道后，主要是通過分子間氫鍵與之結合。

圖6 氣凝膠裝載精油前后的傅里葉紅外分析Fig.6 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of aerogels before and after loading essential oils

2.7 熱重分析

圖7為復合氣凝膠裝載丁香精油前后的TG曲線(30～600 ℃溫度范圍)?？瞻捉M第一段顯著熱失重出現在30～110 ℃，主要原因是氣凝膠吸附的空氣中水分的逸出?？瞻捉M曲線在這一階段的差異反映了高濃度PUL的氣凝膠具有更強的吸濕性；110～290 ℃的熱重變化則是由于PUL的部分分解和水分的進一步散失造成的；290～350 ℃則產生了WPI與PUL的大規(guī)模裂解，期間復合氣凝膠質量損失約為70%。溫度高于350 ℃之后，質量損失速度減緩，這部分損失是剩余殘渣碳化使得氮氧元素丟失造成的。裝載丁香精油的復合氣凝膠第一段明顯熱失重則是在120～180 ℃，質量損失高達71%，這階段主要是丁香精油的揮發(fā)所致。

圖7 氣凝膠裝載精油前后的TG曲線Fig.7 TG curves of aerogels before and after loading essential oils

3 結論

PUL添加量、pH、凝膠溫度、凝膠時間、交聯(lián)劑添加量、冷凍干燥時間等均對WPI-PUL復合氣凝膠的性能有著一定影響。前期通過在單因素實驗基礎上進行Plackett-Burman 設計，選出3個最顯著因素：PUL添加量、pH與凝膠溫度。通過Box-Behnken 模型以氣凝膠的丁香精油裝載性能為響應值進行優(yōu)化并驗證得到最優(yōu)制備條件為：PUL添加量55 mg/mL, pH值7.9，凝膠溫度84 ℃。最優(yōu)條件下制得復合氣凝膠樣品對丁香精油有著良好的裝載性能及緩釋性能，最大裝載率為254.23%。在水體系中，釋放360 min 后達到最大釋放率，為48.94%，釋放方程：r=6.456E-6t3-0.004t2+0.647t+9.339；在95%(體積分數)乙醇體系中，釋放420 min后達到最大釋放率，為65.59%，釋放方程：r=8.106E-6t3-0.005t2+0.850t+11.359(95%乙醇)。平衡吸濕率為11.41%，相比純WPI或PUL氣凝膠均有所降低，更適于活性物質的裝載與貯藏。裝載丁香精油前壓縮模量21.745 MPa，有著較好的抗壓性能，裝載后仍有11.247 MPa，可滿足正常應用需求。

綜合來看，選用PUL添加量55 mg/mL, pH值7.9，凝膠溫度84 ℃制備的WPI-PUL復合氣凝膠可以得到有著良好的機械強度、丁香精油裝載率和緩釋性能以及低吸濕率的氣凝膠產品，適用于活性包裝載體、食品微膠囊及生物醫(yī)藥載體的開發(fā)與應用，同時可為氣凝膠的制備提供了指導意義。