沙小梅，王光耀，胡姿姿，胡文蕓，涂宗財(cái),2*

1(江西師范大學(xué) 國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心和江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌，330022)2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047)

明膠是由膠原蛋白經(jīng)適度水解后得到的一類高分子蛋白質(zhì)，主要從動(dòng)物的皮膚、骨等結(jié)締組織進(jìn)行提取[1],其具有凝膠性、發(fā)泡和乳化特性等多種功能特性，因而在食品、醫(yī)藥、化妝品和其他行業(yè)有廣泛的應(yīng)用[2-3]。目前，約有95%的食用明膠來自哺乳動(dòng)物，主要為豬和牛[4]。豬明膠是市場上使用最廣泛的明膠，但因手足口病的爆發(fā)，使其安全性受到消費(fèi)者的質(zhì)疑；其次受宗教信仰和素食主義的影響，使得對豬明膠進(jìn)行溯源而備受關(guān)注[5]。目前，食用明膠的溯源常見的方法主要有PCR，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，電泳技術(shù)和傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)等[6-9]。但由于食用明膠尤其是哺乳動(dòng)物明膠的序列同源性非常高，其前體膠原蛋白的氨基酸序列相似度高達(dá)95%，且不同哺乳動(dòng)物明膠之間的差異僅存在于一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分氨基酸序列中，給溯源帶來很大困難，導(dǎo)致上述溯源方法難以確認(rèn)溯源效果，同時(shí)以上方法僅能用于純明膠的溯源，不適用于明膠混合物。

近年來，質(zhì)譜技術(shù)逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法成為溯源蛋白質(zhì)的新方法，其原理是依據(jù)膠原蛋白氨基酸序列之間的細(xì)微差異搜索不同來源的特征多肽，從而準(zhǔn)確追溯明膠來源。質(zhì)譜溯源因其快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)而被廣泛關(guān)注，如WARD等[10]成功地借助生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定出源于豬、牛、魚和雞的4種明膠；在工業(yè)明膠的鑒定中，KUMAZAWA等[11-12]利用LC-MS成功鑒別出來源于豬、馬、牛、山羊和綿羊的不同明膠；GRUNDY等[13]用質(zhì)譜技術(shù)追溯食品和藥品中明膠的來源，其結(jié)果比使用ELISA和PCR方法的效果更好。目前，食用明膠的研究大多數(shù)都集中在明膠混合物和食品體系中明膠來源的鑒定，而原料對于豬皮明膠溯源性影響的研究較少[14]。

食用明膠的原料主要為豬皮、牛皮和驢皮，其中豬皮占主導(dǎo)地位。皮膚為動(dòng)物感知外界環(huán)境的感受器，其對于外界環(huán)境變化十分敏感，尤其是溫度。此前，相關(guān)研究證明不同季節(jié)肌內(nèi)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)有所差異[15-16]，繼而推測不同季節(jié)的豬皮膠原蛋白也具有類似的差異。通過文獻(xiàn)查詢發(fā)現(xiàn)，夏季和冬季的魚皮明膠在凝膠特性方面有所差異[17]，但不同季節(jié)對豬皮明膠凝膠特性和溯源影響的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，因此值得深入探究。在4個(gè)季節(jié)中，冬季和夏季的溫度差異最大，故選擇冬季和夏季宰殺之后得到的豬皮為原料提取明膠，應(yīng)用剪切應(yīng)力流變儀和質(zhì)構(gòu)分析儀對豬皮明膠的凝膠特性(如凝膠強(qiáng)度，膠融溫度和膠凝溫度)進(jìn)行分析，探究冬季和夏季的豬皮原料是否會(huì)對提取明膠的凝膠特性產(chǎn)生影響；同時(shí)，應(yīng)用線性離子阱高分辨率質(zhì)譜技術(shù)(linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry，LTQ/Orbitrap MS/MS)研究冬夏季節(jié)豬皮明膠的溯源性差異。本研究通過探究冬夏季節(jié)豬皮明膠凝膠性能的差異以及尋找不隨季節(jié)變化的豬皮明膠特征多肽，為豬皮明膠的溯源數(shù)據(jù)庫提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬皮，正邦集團(tuán)(江西南昌)，品種均為三元豬(即長白豬和大白豬雜交得到二元母豬，二元母豬與杜洛克公豬雜交得到三元豬)：年齡為6～7月，性別為母豬或閹割后公豬，室內(nèi)飼養(yǎng)溫度為16～18 ℃，濕度為55%～65%，體重約為110 kg。宰殺時(shí)間分別為8月份(室外平均溫度28～35 ℃)和12月份(室外平均溫度5～12 ℃)。每個(gè)季節(jié)選擇3頭豬的豬皮。

胰蛋白酶(酶活力：16 376 U/mg)，美國Promega公司；異丙醇、NaOH(均為分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

FA1104 N型電子分析天平，上海丙林電子科技有限公司；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LGJ-1D-80型冷凍干燥機(jī)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀，英國Stable Micro System公司；Paar-Physica MCR 302型剪切應(yīng)力控制流變儀，德國Anton Paar公司；Q-Exactive 質(zhì)譜儀、EASY-nLCTM1000色譜系統(tǒng)，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

采用本課題組前期的制備方法[18]，將豬皮切成1 cm×1 cm的方形，清洗干凈后加入異丙醇浸泡脫脂過夜。再按照料液比為1∶10(g∶mL)向豬皮中加入0.1 mol/L NaOH溶液，在15～20 ℃條件下攪拌反應(yīng)2 h，每40 min更換1次NaOH溶液。然后將豬皮洗凈至pH 7.0，按照料液比為1∶10(g∶mL)再加入0.2 mol/L HCl溶液，在15～20 ℃條件下攪拌反應(yīng)4 h，每隔1 h更換1次HCl溶液。最后將豬皮洗凈至pH 7.0。豬皮明膠的制備工藝為豬皮與超純水的料液比為1∶3(g∶mL)，加熱溫度為55 ℃，提取時(shí)間為6 h。過濾除去豬皮殘?jiān)?，將濾液凍干得到豬皮明膠，冷藏備用。

1.2.2 凝膠強(qiáng)度測試

使用TA-XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀測定豬皮明膠的凝膠強(qiáng)度。將凍干后的明膠配制成質(zhì)量濃度為6.67 mg/mL的明膠溶液，量取15 mL配制好的明膠溶液，置于4 ℃冷藏16～17 h至完全凝膠。用P/0.5R 探頭測定冷藏后膠體的凝膠強(qiáng)度，探頭測試速度為1 mm/s，將探頭下壓至膠體內(nèi)部4 mm處時(shí)施加的力定義為膠體的凝膠強(qiáng)度[19]。

1.2.3 流變學(xué)測試

采用HUANG等[20]的方法，使用剪切應(yīng)力流變儀的CC27轉(zhuǎn)子測量明膠的流變特性(溫度掃描、頻率掃描)。

溫度掃描：移取19 mL 6.67 mg/mL豬皮明膠溶液置于圓筒(CC27，MCR302)中，溶液先從40 ℃降溫至5 ℃，再從5 ℃升溫至40 ℃，速率均為0.5 ℃/min，應(yīng)變力為0.5%, 頻率為1 Hz。

頻率掃描：對凝膠后的膠體進(jìn)行頻率測試，溫度為5 ℃，應(yīng)變力為0.5%，頻率在0.01～10 Hz的線性黏彈范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.4 樣品酶解

將凍干后的樣品溶解于SDT緩沖液(4 mg/mL十二烷基磺酸鈉、100 mmol/L二硫蘇糖醇、150 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl溶液)配制成1 μg/μL溶液，于沸水中加熱3 min，室溫冷卻后加入200 μL 8 mol/L尿素裂解液并轉(zhuǎn)入10 kDa超濾管，14 000×g離心30 min，棄下層濾液；再加入100 μL 100 mmol/L的碘乙酰胺溶液(含尿素裂解液)混勻1 min后放至暗處，靜置20 min 后14 000×g離心15 min，接著再加入100 μL 8 mol/L尿素裂解液，繼續(xù)14 000×g離心15 min，重復(fù)3次后棄下層濾液；向濃縮液中加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液后14 000×g離心30 min，此步驟重復(fù)3次；而后更換2 mL離心管。加入50 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液以及2 μg胰蛋白酶混勻1 min，37 ℃下反應(yīng)20 h，反應(yīng)完后離心收集濾液，即可得到酶解產(chǎn)物。

1.2.5 HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS

采用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS對酶解后產(chǎn)物進(jìn)行分析。先使用納升流速液相系統(tǒng)HPLC-EASY-nLC 1000 對其進(jìn)行分離。流動(dòng)相：A液[V(乙晴)∶V(甲酸)∶V(水)=2∶0.1∶97.9]，B液[V(乙晴)∶V(甲酸)∶V(水)=84∶0.1∶15.9]。色譜柱Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm (RP-C18)以100%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，再經(jīng)色譜柱分離，流速為0.3 μL/min。流動(dòng)相梯度如下表1所示，酶解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長：60 min，母離子掃描范圍(m/z)：300～1 800，多肽和多肽的碎片的質(zhì)荷比按照下列方法采集：MS在m/z200時(shí)分辨率為70 000，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間：40.0 s；每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜，MS/MS 在m/z200時(shí)分辨率為17 500，裂解類型：HCD，歸一化碰撞能量：30 eV，底部填充率：0.1%。

表1 液相梯度設(shè)置Table 1 Liquid gradient settings

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用MASCOT 2.2針對豬膠原蛋白檢索MS/MS質(zhì)譜。檢索參數(shù)：固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化；可變修飾：氧化(P，K和M)；最大未酶切位點(diǎn)為2；一級(jí)質(zhì)譜錯(cuò)誤率為±20 ppm；二級(jí)質(zhì)譜錯(cuò)誤率為±0.1 Da；當(dāng)Mascot分?jǐn)?shù)>40時(shí)，多肽峰被認(rèn)定為陽性鑒定或準(zhǔn)確度極高(P<0.05)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠強(qiáng)度

凝膠強(qiáng)度是評價(jià)明膠質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，冬夏兩季豬皮明膠的凝膠強(qiáng)度如表2所示。隨著季節(jié)平均溫度的升高，明膠的凝膠強(qiáng)度由(811.0±0.6) g增加到(877.1±0.6) g，說明不同季節(jié)對豬皮明膠凝膠強(qiáng)度有著顯著影響。這與段蕊等[22]的結(jié)果類似，原因在于明膠分子鏈越長，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)越緊密，凝膠強(qiáng)度越大，且冬季的膠原蛋白穩(wěn)定性低于夏季，在明膠提取過程中，冬季膠原蛋白較夏季更易斷裂成小分子鏈，易導(dǎo)致冬季明膠的凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)松散，呈現(xiàn)較低的凝膠強(qiáng)度。

表2 冬夏豬皮明膠凝膠強(qiáng)度Table 2 Gel strength of winter and summer pigskin gelatin

2.2 流變學(xué)分析

2.2.1 溫度掃描

當(dāng)材料形變時(shí)，由彈性形變而存儲(chǔ)在材料中的能量指標(biāo)稱為G′，而損失的能量指標(biāo)稱為G″[5]。在加熱和冷卻期間，在不同季節(jié)提取的豬皮明膠中G′和G″的變化如圖1所示。冬夏季節(jié)豬皮明膠的凝膠和融膠過程中G′和G″的變化趨勢基本相同，均是隨著溫度降低而升高，隨著溫度升高而降低。當(dāng)溫度逐漸升高時(shí)，豬皮明膠逐漸變?yōu)橐簯B(tài)，此時(shí)豬皮明膠的G′低于其G″，表明豬明膠分子是單鏈狀態(tài)。當(dāng)隨著溫度降低，G′和G″曲線變得更陡峭，尤其G′迅速增加，是由于在離子相互作用、氫鍵、范德華力、疏水作用等非共價(jià)鍵作用下明膠分子鏈發(fā)生從單鏈到三重螺旋的自組裝轉(zhuǎn)變的過程[19]。

在冷卻和加熱期間，G′和G″存在一個(gè)交點(diǎn)，并在該點(diǎn)處于平衡狀態(tài)。此外，在冷卻和加熱曲線上的G′和G″的交叉點(diǎn)被定義為膠凝點(diǎn)和膠融點(diǎn)，此時(shí)對應(yīng)的溫度分別為膠凝溫度和膠融溫度。由表2可知，冬季和夏季明膠膠融溫度分別為(26.7±0.7)、(27.9±0.6) ℃，膠凝溫度分別為(18.3±0.0)、(19.6±1.2) ℃。明膠的膠融溫度和膠凝溫度均隨著季節(jié)溫度的升高而升高，這可能是由于季節(jié)溫度的升高增加了膠原蛋白的穩(wěn)定性，從而影響了明膠的凝膠特性[23]。

2.2.2 頻率掃描

在凝膠上施加擺動(dòng)力矩會(huì)導(dǎo)致膠體分子在該時(shí)刻移動(dòng)。當(dāng)擺動(dòng)力矩的頻率從低到高變化時(shí)，分子鏈的運(yùn)動(dòng)也相應(yīng)地變化，并且可以測量其黏彈性能。G′反映了外力變化時(shí)系統(tǒng)分子形變的能量，G″則反映了分子鏈內(nèi)或分子之間的外力引起的系統(tǒng)分子力變化所產(chǎn)生的能量損失。明膠的頻率掃描可以表征其凝膠強(qiáng)度，如圖1-e所示，冬夏兩季豬皮明膠的G′隨頻率增加而增加，說明凝膠化仍在進(jìn)行中。冬季豬皮提取的明膠顯示出更低的G′，這與2.1中的凝膠強(qiáng)度結(jié)果相一致。原因可能是較低的環(huán)境溫度降低了膠原蛋白的穩(wěn)定性，導(dǎo)致明膠分子質(zhì)量降低，從而使得內(nèi)部的凝膠網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)減少[23]。

tanδ值(G″/G′)可以進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果，tanδ值越低表明凝膠體系受外力影響時(shí)的能量損失越低，即tanδ值較低時(shí)，其凝膠會(huì)形成更牢固的凝膠網(wǎng)絡(luò)。如圖1-f所示，夏季豬皮明膠的tanδ均低于冬季豬皮明膠，表明夏季豬皮明膠能形成更穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。此外，冬夏兩季豬皮明膠的tanδ均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，且tanδ值均小于0.1，說明2種明膠均能獲得了良好的凝膠網(wǎng)絡(luò)或更接近固體的性質(zhì)。但隨著頻率的逐漸增大，tanδ值逐漸增加，表明高頻率掃描會(huì)逐漸破壞膠體的內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[24]。

a-降溫過程中豬皮明膠G′；b-降溫過程中豬皮明膠G″；c-升溫過程中豬皮明膠G′；d-升溫過程中豬皮明膠G″；e-頻率掃描過程中豬皮明膠G′；f-頻率掃描過程中豬皮明膠的tanδ值圖1 冬夏季節(jié)豬皮明膠的流變學(xué)特性Fig.1 The rheological properties of pigskin gelatin in winter and summer

2.3 質(zhì)譜鑒定特征多肽

2.3.1 豬明膠理論特征多肽

本課題組前期通過比對豬牛明膠序列，建立了豬、牛明膠理論特征多肽數(shù)據(jù)庫[25]，通過數(shù)據(jù)庫查詢可知，豬明膠具有69種理論上的特征性多肽，其中包含27條源自α1鏈的特征多肽和42條源自α2鏈的特征多肽。因此可通過這些特征多肽序列溯源豬明膠。

2.3.2 冬夏兩季豬皮明膠的特征多肽總體分析

本研究利用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS鑒定不同季節(jié)豬皮明膠的特征多肽。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的結(jié)果表明，夏季豬皮明膠包含80條特征多肽，冬季豬皮明膠包含66條特征多肽。夏季豬皮明膠特征多肽數(shù)量明顯高于冬季豬皮明膠，這可能是由于夏季豬皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強(qiáng)，其多肽序列在提取過程中能夠更好地被保留，具有更多的酶切位點(diǎn)，被胰蛋白酶酶切之后釋放出更多的特征多肽。將冬夏季豬皮明膠特征多肽進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)夏季豬皮明膠含有36條特有的特征多肽，冬季豬皮明膠含有22條，同時(shí)有44條特征多肽不會(huì)隨季節(jié)變化而改變。為了進(jìn)一步比較不同季節(jié)對明膠序列斷裂位置的影響，不考慮修飾情況，以斷裂位點(diǎn)為橫坐標(biāo)，比較冬夏季節(jié)特征多肽的分布情況。由圖2可知，夏季明膠較冬季明膠添加了4個(gè)序列段，α1鏈和α2鏈各2個(gè)，亦說明夏季膠原蛋白有著更好的穩(wěn)定性，在提取過程中保存更多的多肽序列，對明膠的溯源有一定幫助。

a-豬明膠α1鏈；b-豬明膠α2鏈圖2 冬夏豬皮明膠特征多肽序列的分布Fig.2 Distribution of characteristic peptide sequences of winter and summer pigskin gelatin

2.3.2.1 冬夏兩季豬皮明膠的非共有特征多肽

為說明不同季節(jié)對豬皮明膠特征多肽的影響，將來自不同季節(jié)豬皮的2個(gè)明膠樣品中相同的特征多肽定義為共有特征多肽，將2個(gè)明膠樣品中不同的特征多肽定義為非共有特征多肽。利用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS分別對冬夏季節(jié)豬皮中提取的豬皮明膠進(jìn)行檢測。結(jié)果如表3和表4所示，冬夏季豬皮明膠非共有特征多肽數(shù)分別為22和36，其中未修飾特征多肽數(shù)分別為2和3。冬夏季節(jié)豬皮明膠的2種未修飾的非共有特征多肽的串聯(lián)質(zhì)譜圖如圖3所示，冬季豬皮明膠中鑒定出m/z為1 037.011 62+的920GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR943(圖3-a)及夏季豬皮明膠中鑒定出的m/z為486.231 42+的942QGPSGPSGER951(圖3-b)的峰。2種特征多肽的質(zhì)量與理論質(zhì)量非常匹配，MS/MS產(chǎn)生的一系列y和b離子都顯示這2種特征性胰蛋白酶肽的序列的準(zhǔn)確性。不論是否帶有修飾，這些非共有特征多肽只能在冬季或夏季豬皮明膠中單獨(dú)被找到，即隨著季節(jié)變化而改變，因此不能作為豬皮明膠溯源的特征多肽。

表3 冬季豬皮明膠非共有特征多肽Table 3 Non-common characteristic peptides of winter pigskin gelatin

表4 夏季豬皮明膠非共有特征多肽Table 4 Non-common characteristic peptides of summer pigskin gelatin

續(xù)表4

a-豬皮明膠α1鏈920GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR943；b-豬皮明膠α1鏈942QGPSGPSGER951圖3 串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的豬皮明膠特征多肽Fig.3 Porcine skin gelatin characteristic peptides identified by tandem mass spectrometry

2.3.2.2 冬夏兩季豬皮明膠的共有特征多肽

2種豬皮明膠中的44條共有特征多肽(9條源自α1鏈和35條源自α2鏈)如表5所示，這些共有特征多肽不會(huì)隨季節(jié)的變化而改變，可作為特征多肽用于豬皮明膠的溯源。由表5可知，這些共有特征多肽序列共有2種形式：第1種形式為未修飾的特征多肽序列，包括174SAGISVPGPMGPSGPR189、1052GETGPAGPAGPVGPVGAR1069、85G VGAGPGPMGLMGPR99、424GPTGPAGVR432和1068TGQPGA VGPAGIR1080；第2種形式為包含羥基化修飾的特征多肽序列。膠原蛋白脯氨酸羥基化以及膠原蛋白的部分水解會(huì)產(chǎn)生的大量羥脯氨酸[26-27]。因而存在序列相同但修飾不同的特征多肽片段，其復(fù)雜的修飾情況使序列識(shí)別更加困難，如不同數(shù)目的羥基化修飾位點(diǎn)和相同的修飾數(shù)目但不同的修飾位置。

圖4為冬夏豬皮明膠的3個(gè)共有特征多肽的二級(jí)質(zhì)譜圖。3個(gè)特征多肽的氨基酸序列相同，但具有不同的羥基化修飾位點(diǎn)。m/z值分別為719.374 32+(圖4-a)、727.375 12+(圖4-b)和735.373 72+(圖4-c)的3個(gè)峰均來自豬皮明膠α2鏈，分別具有1、2和3個(gè)脯氨酸羥基化位點(diǎn)。這3種共有特征多肽的質(zhì)量與理論值(1 469.738 3、1 453.743 4和1 437.748 5)很好地匹配。MS/MS產(chǎn)生的一系列y和b離子準(zhǔn)確地證明了這3個(gè)共有特征多肽均來自同一序列。

值得注意的是，通過一級(jí)質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定出的胰蛋白酶肽序列中可以檢測到具有不同電荷(+1、+2、+3，+4和+5)的片段，其中+2和+3最常出現(xiàn)。在表5中，出于均一性考慮，列出的特征多肽的價(jià)態(tài)均為+2和+3。從理論上講，各種電荷的質(zhì)譜峰均可用于鑒定和分析蛋白質(zhì)。

表5 冬夏季節(jié)豬皮明膠共有特征多肽Table 5 Common peptides of pigskin gelatin in winter and summer

a-豬皮明膠的α2鏈中的特征多肽574GIPGEFGLP*GPAGPR588(Pro582被羥基化)；b-特征多肽574GIP*GEFGLP*GPAGPR588(Pro576和Pro582被羥基化)；c-特征多肽574GIP*GEFGLP*GP*AGPR588Pro576, Pro582和Pro584被羥基化)圖4 通過串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定特征多肽的不同修飾水平Fig.4 Identification of different modification levels of characteristic peptides by tandem mass spectrometry

3 結(jié)論

綜上所述，不同季節(jié)對豬皮明膠的凝膠特性有顯著影響，當(dāng)夏季轉(zhuǎn)變?yōu)槎緯r(shí)，豬明膠的凝膠強(qiáng)度由(877.1±0.6) g降低為(811.0±0.6) g；膠凝溫度由(27.92±0.55) ℃降低為(26.7±0.7) ℃；膠融溫度由(19.6±1.2) ℃降低為(18.3±0.0) ℃，表明豬皮明膠隨著季節(jié)溫度的降低而有所降低，易斷裂為小分子鏈，導(dǎo)致冬季明膠凝膠特性較差。進(jìn)一步運(yùn)用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS，從冬夏兩季豬皮提取的豬皮明膠中分別鑒定出了66和80個(gè)特征多肽，其中包含有44種共有特征多肽序列，不會(huì)隨著季節(jié)的變化而改變，這些共有的特征多肽序列可以作為豬皮明膠溯源的依據(jù)。流變學(xué)、質(zhì)構(gòu)分析和質(zhì)譜結(jié)果均表明，季節(jié)的變化會(huì)影響豬皮明膠的流變學(xué)特性和溯源性，所以豬皮明膠的溯源應(yīng)優(yōu)先考慮那些具有穩(wěn)定性的共有特征多肽。同時(shí)，還應(yīng)考慮其他外界因素可能會(huì)干擾識(shí)別，例如飼養(yǎng)方式和條件。后期需要進(jìn)一步研究不同外界因素對明膠溯源性的影響，以提高豬皮明膠溯源的準(zhǔn)確性。