周玲 李秋月 雷從改 符芳霞 李云 程斌 覃銳 劉天密

摘要 選擇經(jīng)常檢出的磺胺嘧啶作為研究對象，通過測定不同保存條件下羅非魚中不同濃度磺胺嘧啶的穩(wěn)定性，確定羅非魚磺胺類藥物監(jiān)測中的樣品保存條件和運(yùn)輸溫度條件。結(jié)果表明，樣品中不同濃度的磺胺嘧啶均有不同程度的降解，但因保存條件的不同，降解速率各不相同。在常溫條件下保存，羅非魚樣品中磺胺嘧啶的濃度越高，降解速度越慢;在冷藏條件下保存，羅非魚樣品中磺胺嘧啶濃度越高，也呈降解速度越慢的趨勢;在冷凍條件下保存，羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解速度沒有明顯的變化。羅非魚樣品中不同濃度的磺胺嘧啶在3種保存條件下（常溫25～28 ℃，冷藏0～4 ℃，冷凍-18～-22 ℃）的降解速率為常溫>冷藏>冷凍。因此，用于磺胺嘧啶檢測的羅非魚樣品應(yīng)貯存于冷凍條件下，并盡快分析。

關(guān)鍵詞 羅非魚樣品;磺胺嘧啶;降解規(guī)律

中圖分類號 S 948? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）16-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.047?? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Degradation of Sulfadiazine under Different Storage Conditions in Tilapia Fish Muscle Samples

ZHOU Ling，LI Qiu-yue，LEI Cong-gai et al

（Testing Center for Aquatic Products Quality and Safety of Hainan Province，Haikou， Hainan 570206）

Abstract The frequently detected sulfadiazine was selected as the research object. To ensure the transportation temperature and storage conditions of tilapia fish muscle samples for monitoring of sulfonamides by detecting the stability of different concentrations of sulfadiazine in tilapia fish muscle samsulfonamidesples under different storage conditions. The results showed that sulfadiazine of different concentrations in tilapia fish muscle samples degraded with various degrees， however， the degradation rate varied due to different storage conditions. The degradation rate of sulfadiazine in tilapia fish muscle samples were both slower with the increase of sulfadiazine concentration at room temperature and cold storage. But there was no significant change in the degradation rate of sulfadiazine in tilapia fish muscle samples stored under freezing condition. The result also showed that the degradation rate of sulfadiazine at different concentrations in tilapia fish muscle samples under three storage conditions were in order of room temperature condition > refrigerated condition > freezing condition. Therefore， tilapia fish muscle samples for sulfadiazine detection should be stored under freezing conditions and analyzed as soon as possible.

Key words Tilapia fish muscle samples;Sulfadiazine;Degradation law

磺胺類藥物為人工合成的抗菌藥，它具有抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定、使用簡便等優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用[1]。但是，如果磺胺類藥物使用不當(dāng)或使用時未遵守其休藥期，可造成藥物在動物組織中的殘留[2-3]。殘留的藥物不僅會對人的健康造成潛在危害，引起過敏反應(yīng)、腎臟損壞、白細(xì)胞減少癥等，還是水產(chǎn)品出口貿(mào)易中的主要障礙[4]。2015年美國FDA發(fā)布拒絕進(jìn)口產(chǎn)品通報，其中我國廣西、海南等地多批羅非魚因獸殘問題被拒絕入境。因?yàn)榛前穯栴}，給我國的羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重影響，造成養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶的巨大經(jīng)濟(jì)損失。

美國、歐盟、日本等已禁止磺胺類藥物用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。羅非魚磺胺類藥物殘留監(jiān)測迫在眉睫。以往的研究多集中于活體動物藥代動力學(xué)和檢測方法方面[5-10]，而不同保存條件對羅非魚中磺胺類藥物檢測結(jié)果的影響鮮見報道。該研究選擇經(jīng)常檢出的磺胺嘧啶作為研究對象，擬通過測定不同保存條件下羅非魚中不同濃度磺胺嘧啶的穩(wěn)定性，以確定羅非魚磺胺類藥物監(jiān)測中樣品的保存條件和運(yùn)輸溫度條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對象和藥物

通過走訪、調(diào)查和2015—2017年的專項(xiàng)抽檢發(fā)現(xiàn)，磺胺類藥物中磺胺嘧啶最易超標(biāo)。由于磺胺嘧啶是限用藥，選用上市規(guī)格的羅非魚作為研究對象，羅非魚500 g/尾左右。試驗(yàn)羅非魚購自海南振宇實(shí)業(yè)有限公司，并租用該公司7個養(yǎng)殖網(wǎng)箱進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)，設(shè)有增氧設(shè)備。每個養(yǎng)殖網(wǎng)箱投放20尾羅非魚，試驗(yàn)羅非魚暫養(yǎng)10 d后開始投喂拌藥飼料。

試驗(yàn)用磺胺嘧啶為標(biāo)準(zhǔn)試劑（≥98.0%），采用拌料投喂的方式進(jìn)行給藥。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

設(shè)置4、8、12 mg/kg 3個不同給藥濃度，每個濃度2個平行，6個試驗(yàn)組，1個空白對照組（CK），共7個組。除了藥物濃度不同，其他養(yǎng)殖條件保持一致。給藥前7 d在實(shí)驗(yàn)室將不同藥物濃度的飼料拌好晾干分裝并存放于冰柜中。6月19日開始分別在6個試驗(yàn)網(wǎng)箱中投喂相應(yīng)濃度的拌藥飼料。給藥7 d后，隨機(jī)抽取10尾羅非魚，取其肌肉制成肉糜在不同條件下保存[常溫（25～28 ℃）、冷藏（0～4 ℃）和冷凍（-18～-22 ℃）]。

常溫保存下易變質(zhì)，樣品于保存的第0、1、2、3、6天取出，檢測其磺胺嘧啶含量，冷藏樣品于保存的第0、1、2、3、6、10、20天取出，冷凍樣品于保存的第0、1、2、3、6、10、20、30、41天取出，在常溫下解凍后檢測磺胺嘧啶含量。

7個養(yǎng)殖網(wǎng)箱中剩下的羅非魚繼續(xù)養(yǎng)殖22 d后（按500度日的休藥期進(jìn)行計算，池溫25～28 ℃），捕獲帶回實(shí)驗(yàn)室，分別去磷、去皮，取其肌肉均質(zhì)制成肉糜，檢測其磺胺嘧啶的含量。

1.3 樣品處理

喂藥后7 d，分別捕獲7個養(yǎng)殖網(wǎng)箱的羅非魚，帶回實(shí)驗(yàn)室去磷、去皮，取其肌肉均質(zhì)制成肉糜。按試驗(yàn)設(shè)計要求，每組羅非魚肉糜平均分成21份（常溫5份，冷藏7份，冷凍9份），分別保存于不同環(huán)境條件下。

1.4 主要儀器與試劑

試驗(yàn)儀器：AB SCIEX Triple QuadTM 4500三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，渦旋混合器（英國Stuart SA8），超聲波清洗儀（德國Elma S 300H），低速冷凍離心機(jī)（上海安亭DL-6000B），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（英國Stuart RE300DB）。

試驗(yàn)用水為Milli-Q制備高純水;甲醇、乙腈均為色譜純，購自Merk公司;甲酸為色譜純，購自上?？泼軞W公司;乙酸銨為色譜純，購自阿拉丁公司;磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京壇墨公司;磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3標(biāo)準(zhǔn)品，購自農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心。

1.5 樣品檢測

試驗(yàn)方法參照《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008》《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 GB/T 21316—2007》及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。0 d的回收率99%，2 d的回收率83%。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚樣品保存0 d磺胺嘧啶檢測結(jié)果對比

該試驗(yàn)采取低、中、高3種濃度磺胺嘧啶拌料投喂各試驗(yàn)組羅非魚，以獲得自然的帶有磺胺嘧啶的羅非魚樣品。由表1可知，除了6# 網(wǎng)箱外，各試驗(yàn)網(wǎng)箱中羅非魚磺胺殘留量的測定值與投喂?jié)舛戎g呈正相關(guān)，這可能與6#網(wǎng)箱中羅非魚的進(jìn)食量不佳有關(guān)。各測定值之間存在顯著差異（ P <0.05），即使是相同的投喂?jié)舛龋?、8和12 mg/kg組間也存在顯著差異，這可能是由于自然投喂給藥條件下羅非魚的進(jìn)食量不同所致。試驗(yàn)組間各測定值的變異系數(shù)最小為0.04，最大為0.13，平均值為0.08，這說明在對羅非魚樣品進(jìn)行制樣處理時，攪拌相對比較均勻。而CK的測定值之間差異大，有可能是檢測誤差造成。

2.2 羅非魚樣品中磺胺嘧啶在常溫狀態(tài)下的降解規(guī)律

在常溫下，羅非魚樣品放置2 d開始產(chǎn)生異味，放置6 d后，已經(jīng)完全腐敗，分別檢測保存0、1、2、3、6 d后其磺胺嘧啶含量，檢測結(jié)果見表2。由表2可知，在常溫條件下保存，各試驗(yàn)組羅非魚樣品中磺胺嘧啶含量基本都隨保存時間的延長呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。6 d后，1#羅非魚磺胺嘧啶降解了100%，2#? 降解了86.13%，3# 降解了43.20%，4# 降解了53.87%，5# 降解了34.01%，6# 降解了7540%。這說明在常溫條件下保存，羅非魚中的磺胺嘧啶較易降解。

2.3 羅非魚樣品中磺胺嘧啶在冷藏狀態(tài)下的降解規(guī)律

冷藏條件下保存的羅非魚樣品在保存10 d時出現(xiàn)異味，20 d已經(jīng)腐敗。分別檢測其保存0、1、2、3、6、10、20 d后磺胺嘧啶含量，檢測結(jié)果見表3。由表3可知，在冷藏條件下保存，各試驗(yàn)組羅非魚中磺胺嘧啶含量均隨保存時間的延長呈不斷下降的趨勢。保存6 d后，1#羅非魚磺胺嘧啶降解了1819%，遠(yuǎn)小于常溫組的100%;2# 降解了1443%，遠(yuǎn)小于常溫組的86.13%;3# 降解了12.68%，遠(yuǎn)小于常溫組的43.20%;4# 降解了14.95%，遠(yuǎn)小于常溫組的53.87%;5# 降解了4.36%，遠(yuǎn)小于常溫組的34.01%;6# 降解了18.94%，遠(yuǎn)小于常溫組的75.40%。20 d后，1# 羅非魚磺胺嘧啶降解了19.56%，2# 降解了17.95%，3# 降解了22.87%，4# 降解了1698%，5# 降解了11.11%，6# 降解了30.88%，均低于常溫下保存6 d的降解百分比。這說明相較于常溫條件下保存，羅非魚樣品中的磺胺嘧啶在冷藏條件下保存的降解速度要慢得多。

2.4 羅非魚樣品中磺胺嘧啶在冷凍狀態(tài)下的降解規(guī)律

在冷凍條件下保存41 d，羅非魚樣品未出現(xiàn)異味，分別檢測其保存0、1、2、3、6、10、20、30、41 d后磺胺嘧啶的含量，檢測結(jié)果見表4。由表4可知，在冷凍條件下保存6 d后，1#、2#、3#、4#、5#和6#組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解百分比分別為11.01%、16.88%、10.60%、5.86%、5.79%和6.79%，遠(yuǎn)小于常溫下保存6 d各組的降解百分比，1#、3#、4#和6# 組小于冷藏保存6 d各組的降解百分比，2#和5#組無明顯差異;在冷凍條件下保存10 d后，1#、2#、3#、4#、5#和6# 組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解百分比分別為5.12%、8.97%、4.13%、946%、6.93%和4.54%，出現(xiàn)了不降反升的現(xiàn)象。在冷凍條件下保存20 d后，各組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解百分比分別為16.75%、20.48%、17.43%、2035%、18.26%和25.61%，與冷藏保存20 d各組的降解百分比沒有明顯差異;在冷凍條件下保存41 d，各組羅非魚樣品的磺胺嘧啶含量均呈下降趨勢。

2.5 休藥后的檢測結(jié)果

7個養(yǎng)殖網(wǎng)箱中剩下的羅非魚繼續(xù)養(yǎng)殖22 d（過休藥期）后，由于部分羅非魚死亡，只有1#、2#、3#、4#和6# 網(wǎng)箱中還有羅非魚存活，分別取其肌肉制成肉糜，經(jīng)檢測，1#、2#、3#、4#和6# 網(wǎng)箱羅非魚樣品磺胺嘧啶的測定值分別為14.31、19.58、10.35、26.52和11.24 μg/kg，遠(yuǎn)小于國定規(guī)定的限量值100 μg/kg。這說明在羅非魚養(yǎng)殖過程中使用磺胺嘧啶后，只要嚴(yán)格執(zhí)行休藥期的規(guī)定，磺胺嘧啶含量基本均能降解到安全范圍內(nèi)。

3 討論

3.1 該試驗(yàn)的創(chuàng)新與不足

與以往采用加標(biāo)獲得試驗(yàn)用陽性樣品的方式不同，該試驗(yàn)采用與養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)際一致的拌料投喂的給藥方式。雖然低濃度、中濃度和高濃度組間羅非魚樣品中最終磺胺嘧啶含量的平行性不佳，但也獲得了具有顯著差異（ P <0.05）的梯度磺胺嘧啶羅非魚樣品。通過拌料投喂的給藥方式，保持了與養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)際的一致性和陽性樣品的真實(shí)性，研究結(jié)果更利于實(shí)際的檢測應(yīng)用。該試驗(yàn)不足之處有3點(diǎn)：不同給藥濃度組間平行不夠，至少設(shè)置3個平行，而該試驗(yàn)只設(shè)置了2個平行;每次檢測至少進(jìn)3針，求3次檢測結(jié)果的平均值，而該試驗(yàn)檢測時只進(jìn)1針，檢測結(jié)果的代表性不足;冷凍樣品的解凍時間未嚴(yán)格保持一致，導(dǎo)致冷凍保存10 d的檢測結(jié)果出現(xiàn)異常。在今后試驗(yàn)研究中要做好前期準(zhǔn)備和試驗(yàn)設(shè)計，減少此類因素對試驗(yàn)結(jié)果造成的影響。

3.2 樣品中藥物濃度對降解速率的影響

常溫條件下，保存6天后各試驗(yàn)組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解速度為1#（100%）>2#（86.13%）>6#（75.4%）>4#（53.87%）>3#（43.2%）>5#（34.01%），濃度越高降解速度越慢;冷藏條件下，保存20 d后各試驗(yàn)組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解速度為6#（30.88%）>3#（22.87%）>1#（19.56%）>2#（17.95%）>4#（16.98%）>5#（11.11%），基本也呈濃度越高降解速度越慢的趨勢。冷凍條件下，保存41 d后各試驗(yàn)組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解速度為4#（52.20%）>6#（43.64%）>2#（36.21）>3#（32.49%）>5#（32.13%）>1#（30.07%），沒有明顯的變化趨勢。

3.3 樣品保存條件對檢測結(jié)果的影響

為了保證樣品中待測成分的穩(wěn)定性，樣品必須儲藏在一定的溫度條件下，對保存時間也有嚴(yán)格的要求。李長皓等[11]研究表明，不同保存條件會影響生鮮乳質(zhì)量安全指標(biāo)的檢測結(jié)果，樣品冷藏時間在48 h以內(nèi)、冷凍時間在30 d以內(nèi)，均對樣品中黃曲霉毒素、鉛、汞、砷、鉻、三聚氰胺的檢測結(jié)果無影響。

當(dāng)保存條件和保存時間不當(dāng)時，就會影響樣品中成分的穩(wěn)定性。該試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，羅非魚樣品中不同濃度的磺胺嘧啶在3種保存條件下（常溫25～28 ℃，冷藏0～4 ℃，冷凍-18～-22 ℃）的降解速率為常溫>冷藏>冷凍。黃向榮等[12]研究結(jié)果表明，不同濃度的孔雀石綠和隱性孔雀石綠在3種貯藏條件下（室溫20～25 ℃，冷藏0～4 ℃和冷凍-18 ℃）均有不同程度的降解，但因貯藏條件的不同，降解速率各不相同，降解速率為常溫>冷藏>冷凍。如果樣品能盡快進(jìn)行檢測，即可在常溫和冷藏條件下進(jìn)行短期保存;如樣品不能盡快安排檢測，則須冷凍保存，但冷凍保存時間也不易過長。趙慧星等[13]研究了蔬菜中殘留農(nóng)藥在不同溫度條件下的降解速率，結(jié)果表明，常溫條件下各農(nóng)藥的降解速率較快，低溫冷藏條件下，各農(nóng)藥降解速度均有所下降，但不同農(nóng)藥在同一溫度條件下的降解速率也不相同。有些藥殘樣品需在冷藏和冷凍條件下保存，但另一些藥殘樣品則需在常溫和冷凍條件下保存。不同貯藏條件下加標(biāo)樣品中的五氯酚鈉均有所降解，降解速率表現(xiàn)為冷藏條件> 常溫條件>冷凍條件[14]。五氯酚鈉加標(biāo)樣品可以在常溫下進(jìn)行短時間保存，便于盡快進(jìn)行檢測;但如樣品不能盡快安排檢測（超過24 h），則需用冷凍保存，以保存樣品的原有屬性，避免影響檢測結(jié)果。

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