劉寶英 梁干雄 葉凱云

糖尿病是一種常見的慢性內(nèi)分泌疾病,臨床根據(jù)其癥狀表現(xiàn)差異可將其分為1 型和2 型兩種,均具有明顯的遺傳特性。目前臨床對其發(fā)病機制的研究尚未有統(tǒng)一的定論,但普遍認(rèn)為與胰島素分泌缺陷或其生物作用受損密切相關(guān)。當(dāng)人體的胰腺B 細(xì)胞功能遭到破壞后,會直接導(dǎo)致機體胰島素分泌不足,機體無法進行有效的代償,從而造成血糖升高,此類患者通常需要終生接受藥物治療,如胰島素等。但有研究表明,T1DM患者發(fā)病年齡通常較低、自控能力較差,血糖控制難度較大,繼而各種并發(fā)癥的發(fā)生率較高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全［1］。腸道菌群作為調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境的一個重要因素,影響著宿主的營養(yǎng)、代謝及免疫,有研究表明,腸道菌群紊亂可能通過改變腸壁通透性及免疫功能參與了T1DM 的進程,故而推測通過給予患者特定的飲食、或是添加益生菌以及使用抗生素等方式可以有效調(diào)整患者腸道內(nèi)的菌群分布情況及腸道菌群的結(jié)構(gòu)分布,從理論上來說有助于延緩T1DM 病情進展［2］。然而隨著生物信息學(xué)和宏基因組學(xué)的快速發(fā)展,腸道微生物作為一個環(huán)境因素在T1DM 中的研究正受到越來越多的重視,但迄今基于人群的研究尚少,國內(nèi)關(guān)于T1DM 患者腸道菌群的研究更是鮮有報道［3］。對此廣東省中山市政府于2014 年開始啟動T1DM 干預(yù)項目。本研究以中山地區(qū)T1DM 干預(yù)項目組入組的T1DM 患者為研究人群,收集研究對象新鮮糞便標(biāo)本,提取糞便基因組DNA,通過生物信息學(xué)分析其腸道菌群結(jié)構(gòu)特征,了解T1DM 患者腸道菌群特點,同時根據(jù)研究對象的HbA1c 水平分組,了解不同血糖控制水平患者腸道菌群差異,發(fā)現(xiàn)與血糖控制相關(guān)的腸道細(xì)菌類型,從而為基于腸道菌群的T1DM 的新的治療方法或基于腸道菌群的T1DM 預(yù)防藥物的開放奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年1 月～2019 年10 月中山市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科診斷為新發(fā)T1DM 患者25 例作為T1DM 組,納入標(biāo)準(zhǔn)：①疾病確診時間≤6 個月；②并發(fā)酮癥酸中毒癥狀；③患者開始接受胰島素治療；④谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)和/或蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)陽性；⑤血清空腹C 肽＜130 pmol/L 或餐后2 hC肽＜330 pmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者患有胃腸道疾病,如便秘、慢性腹脹、消化不良等；②患者患有過敏性或感染性疾?。虎刍颊咴趨⑴c研究前1 個月接受過影響腸道菌群的藥物治療。另選取同期25 例健康體檢者作為對照組,排除標(biāo)準(zhǔn)與T1DM 組一致。T1DM 組男5 例,女20 例；年齡11～68 歲,平均年齡(40.84±10.81)歲；并且同時根據(jù)T1DM 組患者HbA1c 水平分為A 組(HbA1c≤7%,5 例)、B 組(HbA1c 7%～9%,15 例)、C組(HbA1c＞9%,5 例)。對照組男6 例,女19 例；年齡12～67 歲,平均年齡(40.87±9.92)歲。T1DM 組和對照組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。本項研究現(xiàn)已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)和受檢者的知情同意,已簽署知情文書。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集和檢測 首先采集患者的血液標(biāo)本和糞便標(biāo)本,其中血液標(biāo)本采集后放置在-80℃的環(huán)境中保存待檢；而糞便標(biāo)本則需要在排便后2 h 內(nèi)儲存在封閉的儲存盒中,同樣置于相同溫度的環(huán)境中保存,前者進行生化檢驗,后者進行細(xì)菌DNA 的提取及定量,糞便DNA 提取方法根據(jù)試劑盒的說明完成；糞便DNA 的16SrDNAV3-4 的擴增及測序列由生物公司協(xié)助完成。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 將測序得到的序列數(shù)首先應(yīng)用Flash 軟件進行拼接,同時使用QIIME 軟件包過濾序列數(shù)的拼接效果及質(zhì)量,同時校正序列方向,然后采用barcode 標(biāo)簽序列對樣品進行識別和區(qū)分,進而采集有效數(shù)據(jù)；對所有序列進行歸類操作,相似度＞97%序列聚類為一個操作分類單元(OTU),并根據(jù)最新版本過濾OUT。

1.3 觀察指標(biāo) 比較T1DM 組和對照組多樣性指數(shù)差異,多樣性指數(shù)包括Shannon 指數(shù)、Simpson’s 指數(shù)和Chaol 豐富度指數(shù)［4］。比較A 組、B 組、C 組、對照組炎癥指標(biāo)(hs-CRP、IL-6)和多樣性指數(shù)差異；分析腸道菌群與T1DM 患者血糖、炎癥指標(biāo)水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,采用t、F檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；相關(guān)性檢驗采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T1DM 組和對照組多樣性指數(shù)差異比較 T1DM 組Shannon 指數(shù)、Simpson’s 指數(shù)及Chaol 豐富度指數(shù)均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 T1DM 組和對照組多樣性指數(shù)差異比較()

表1 T1DM 組和對照組多樣性指數(shù)差異比較()

注：與對照組比較,aP＜0.05

2.2 A 組、B 組、C 組、對照組多樣性指數(shù)和炎性指標(biāo)比較 A 組、B 組、C 組Shannon 指數(shù)、Simpson’s 指數(shù)、Chaol 豐富度指數(shù)及hs-CRP、IL-6 水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 A 組、B 組、C 組、對照組多樣性指數(shù)和炎性指標(biāo)比較()

表2 A 組、B 組、C 組、對照組多樣性指數(shù)和炎性指標(biāo)比較()

注：四組比較,P＜0.05

2.3 腸道菌群與T1DM 患者血糖、炎癥指標(biāo)水平的相關(guān)性分析 腸道菌群菌種的豐富度和多樣性指數(shù)與血糖水平及炎性因子hs-CRP、IL-6 水平呈正相關(guān)(r=0.622、0.601、0.596,P＜0.05)。

3 討論

近年來,隨著臨床研究的深入,越來越多的專家學(xué)者發(fā)現(xiàn)糖尿病患者存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象,尤其是T1DM 患者更加顯著；而出生環(huán)境、日常飲食以及抗生素和益生菌等藥物則是影響腸道菌群的主要因素,故而推測腸道菌群會影響T1DM 的發(fā)病。一項動物實驗研究發(fā)現(xiàn),在對其輸注特定腸道菌群后,T1DM 癥狀得到有效的預(yù)防和減輕,由此可見兩者之間關(guān)系密切［5］。目前,臨床對兩者之間的相互作用機制尚不明顯,但普遍認(rèn)為可能是腸道屏障功能的改變或者是腸道免疫系統(tǒng)參與T1DM 的發(fā)病過程。

本次研究結(jié)果顯示,T1DM 組Shannon 指 數(shù)、Simpson’s 指數(shù)及Chaol 豐富度指數(shù)均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見,T1DM 患者腸道菌群的豐富性和多樣性明顯高于正常人群,推測其原因可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。腸道不僅是機體最大的免疫器官,更是機體與外界環(huán)境發(fā)生相互作用的最大區(qū)域［6］。與其他組織微環(huán)境相比,腸道微環(huán)境的最大特點是存在定植數(shù)量眾多且群復(fù)雜的腸道微生物,而人類的腸道菌群由超過3500 種細(xì)菌組成。這類菌群的存在一方面用于消化人體的食物殘渣；另一方面它還參與宿主的能量代謝；并且在為人體提供維生素、氨基酸、抗菌素和多肽的同時,還可以分解宿主體內(nèi)的有毒、有害物質(zhì),并且參與腸上皮的生長、分化、炎癥反應(yīng),促進腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟,但在部分外界因素的作用下極易導(dǎo)致其組成分支發(fā)生變化［7］。經(jīng)臨床既往實驗研究發(fā)現(xiàn)［8］,非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠從無菌環(huán)境轉(zhuǎn)至無特異菌群定植的有菌環(huán)境后,胰腺炎程度減輕,糖尿病發(fā)生率降低,但若給予NOD 小鼠長期檸檬酸桿菌或抗生素干預(yù),其腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡、腸道屏障破壞從而誘發(fā)自身免疫反應(yīng),胰腺炎癥加重,糖尿病的發(fā)生率增高,并且糖尿病大鼠的腸道菌群與正常對照不同,其中擬桿菌屬菌群數(shù)量較多,更進一步證實T1DM 進程中存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象。除此以外,本研究結(jié)果還顯示,A 組、B 組和C 組Shannon 指數(shù)、Simpson’s 指數(shù)、Chaol 豐富度指數(shù)及hs-CRP、IL-6 水平均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由此提示,伴隨著人體血糖和炎癥指標(biāo)水平的升高,腸道菌群的豐富性和多樣性也會有明顯升高,推測其原因可能與T1DM 患者自身免疫功能失調(diào)有關(guān),但具體的作用機制仍待進一步深入研究。

綜上所述,T1DM 患者腸道菌群的多樣性和豐富性明顯高于正常人,其血糖和炎癥指標(biāo)水平越高的患者其糞便中的腸道菌種類越豐富,充分表明T1DM 腸道菌群的多樣性和豐富性與血糖和炎癥指標(biāo)水平密切相關(guān)。