葉文正 王珊珊 李詞娟 吳一文 劉漢忠 方木平

黑素瘤是一種惡性黑素細(xì)胞腫瘤,惡性程度高,容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后極差。在黑色素細(xì)胞演變?yōu)楹谏亓黾?xì)胞的過(guò)程中,伴隨多個(gè)癌基因活化以及抑癌基因的失活,BRAF 基因?yàn)槠渲兄?。BRAF 基因是一種癌基因,位于染色體7q34,編碼一個(gè)67000-99000的絲/蘇氨酸蛋白激酶。BRAF 基因在黑素細(xì)胞特異的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中起著關(guān)鍵作用,它參與黑素刺激素活化細(xì)胞表面黑素皮質(zhì)激素-1 受體,進(jìn)而參與黑素細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程。它將細(xì)胞表面的受體和RAS 蛋白通過(guò)MEK 和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相連接,調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育。BRAF 突變后激活MEK-ERK 信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)惡性增殖。歐美研究中,白種人BRAF 基因突變?yōu)?0%～60%［1］,中國(guó)人群黑色素瘤中,BRAF 基因突變率和歐美國(guó)家可能有所差別,本課題組擬通過(guò)研究中國(guó)漢族人皮膚肢端惡性黑素瘤和非肢端惡性黑素瘤BRAF 基因突變和臨床表型及病理特征的關(guān)系,為中國(guó)漢族人皮膚惡性黑素瘤個(gè)體化精準(zhǔn)靶點(diǎn)治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016～2019 年在孝感市中心醫(yī)院皮膚科連續(xù)確診的79 例中國(guó)漢族人惡性黑素瘤患者的石蠟包埋組織,患者中男46 例,女33 例；平均年齡(58.48±13.15)歲。同時(shí)選取同期在本院行手術(shù)切除的80 例中國(guó)漢族人色素痣患者的石蠟包埋組織,患者中男50 例,女30 例；平均年齡(48.01+15.60)歲。整理并收集惡性黑素瘤患者臨床資料包括性別、年齡、發(fā)病部位、Breslow 厚度、有無(wú)潰瘍及臨床分期等。所有病例均由至少1 位皮膚科和1 位病理科副主任及以上醫(yī)師進(jìn)行診斷,疑難病例則由多位皮膚科醫(yī)師和病理科醫(yī)師共同討論后診斷。全部患者均未做化療、放療及抗免疫等治療。該研究通過(guò)本院倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)(sk2017001)。

1.2 腫瘤基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增目的基因 手動(dòng)分離石蠟包埋組織中的腫瘤細(xì)胞,基因組DNA 提取按照上海生工Ezup 柱式動(dòng)物基因組DNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。采用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增BRAF 基因11 和15 外顯子。設(shè)計(jì)巢式PCR 特異性檢測(cè)引物,見(jiàn)表1。引物委托上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。BRAF 基因11 外顯子外圍引物為BRAF-11-FO 和BRAF-11-RO,擴(kuò)增的目的條帶為393 bp,內(nèi)嵌引物為BRAF-11-FI 和BRAF-11-RI,擴(kuò)增目的條帶為329 bp；BRAF 基因15 外顯子外圍引物為BRAF-15-FO 和BRAF-15-RO,擴(kuò)增的目的條帶為458 bp,內(nèi)嵌引物為BRAF-15-FI 和BRAF-15-RI,擴(kuò)增目的條帶為312 bp。PCR 反應(yīng)條件為初始變性95℃ 5 min,變性94℃ 30 s,退火58℃ 30 s,延伸72℃ 60 s,38 個(gè)循環(huán),72℃修復(fù)延伸10 min。5 μl PCR 產(chǎn)物用于凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性。

表1 BRAF 基因11 和15 外顯子引物

1.3 DNA 測(cè)序 20 μl PCR 產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司純化,使用美國(guó)ABI 公司生產(chǎn)的3730XL測(cè)序儀對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,BRAF 基因11 和15 外顯子均選用內(nèi)側(cè)上游引物測(cè)序,應(yīng)用Chromas 軟件分析測(cè)序結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因凝膠電泳鑒定圖

2.1.1 BRAF 基因11 外顯子凝膠電泳圖 7 個(gè)泳道從左到右依次為DNA marker(50 bp ladder)、6 個(gè)不同樣本BRAF 基因外顯子11 的PCR 產(chǎn)物,其中BRAF 基因外顯子11 的PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為329 bp。見(jiàn)圖1。

圖1 BRAF 基因11 外顯子凝膠電泳圖

2.1.2 BRAF 基因15 外顯子凝膠電泳圖 7 個(gè)泳道從左到右依次為DNA marker(50 bp ladder)、6 個(gè)不同樣本BRAF 基因外顯子15 的PCR 產(chǎn)物,其中BRAF 基因外顯子15 的PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為312 bp。見(jiàn)圖2。

圖2 BRAF 基因15 外顯子凝膠電泳圖

2.2 測(cè)序結(jié)果 37 例肢端惡性黑色瘤患者中有7 例發(fā)生BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為18.92%；42 例非肢端惡性黑素瘤患者中有17 例發(fā)生BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為40.48%；80 例色素痣患者中有5 例發(fā)生BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為6.25%,檢測(cè)出的惡性黑素瘤和色素痣BRAF 基因突位于BRAF 基因15 外顯子,且均為V600E(T1799A)突變,11 外顯子未發(fā)現(xiàn)突變。肢端惡性黑色瘤、非肢端惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變率高于色素痣患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三種疾病患者BRAF 基因突變率比較(n,%)

2.3 BRAF 基因突變測(cè)序圖 V600E(T1799A)突變的測(cè)序圖顯示突變所在位點(diǎn)單峰被雙峰取代。見(jiàn)圖3。

圖3 BRAF 基因突變測(cè)序圖

2.4 BRAF 基因突變和惡性黑素瘤臨床特征及病理的關(guān)系 不同年齡、部位、潰瘍情況、Breslow 厚度以及臨床分期惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變情況比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；不同性別惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 79 例惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變和臨床表型及病理的關(guān)系(n)

3 討論

惡性黑素瘤是來(lái)源于黑素細(xì)胞和痣細(xì)胞的惡性腫瘤,近年來(lái)其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì),是臨床上發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一,已經(jīng)成為嚴(yán)重危及我國(guó)人民健康的疾?。?］。黑素瘤患者晚期患者治療方案有限,中位生存期不足1 年［3］。該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,可能與痣細(xì)胞痣惡變、紫外線照射、種族、遺傳、外傷刺激、免疫等多種因素有關(guān),學(xué)者對(duì)黑色素瘤患者腫瘤細(xì)胞的基因突變情況研究顯示黑色素瘤細(xì)胞基因突變主要集中在MAPK 途徑,其中BRAF 基因突變?cè)诤谏亓鲋械陌l(fā)生率顯著高于其他相關(guān)通路蛋白編碼基因。BRAF 基因?qū)儆谘杆偌铀倮w維肉瘤(RAF)基因家族成員,位于染色體7q34,長(zhǎng)約190 kb,同屬RAF 基因家族的還有ARAF 基因和CRAF 基因。BRAF 基因突變?cè)诹夹陨仞牒桶l(fā)育不良痣中可以發(fā)現(xiàn)［4］,在正常的情況下,表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與其受體進(jìn)行結(jié)合并導(dǎo)致其活化,然后激活下游的大鼠肉瘤(RAS)蛋白,RAS 蛋白在激活下游的RAF 蛋白,RAF 蛋白激活MEK 蛋白,MEK 蛋白再激活ERK 蛋白,然后ERK蛋白進(jìn)入細(xì)胞和內(nèi)部通過(guò)激活下游的各種基因的轉(zhuǎn)錄,讓細(xì)胞進(jìn)行增殖、分化、分裂,其中從RAF 到ERK這一段信號(hào)通路叫做MAPK 通路［5］。其參與在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和增殖等方面起著及其重要的作用。BRAF 突變明顯增加了BRAF 激酶活性,激活一系列激酶后,繼而激活RAF/MEK/ERK/MAPK 途徑的信號(hào)傳導(dǎo)通路［6］,引起一系列自細(xì)胞表面至胞核的連鎖反應(yīng),使有絲分裂能力增強(qiáng),導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和分化,從而形成了腫瘤［7］。目前研究發(fā)現(xiàn)有多種BRAF 基因突變類(lèi)型,其中最重要的就是BRAF 基因的第600 個(gè)氨基酸殘基,從纈氨酸殘基(V)變成谷氨酸殘基(E),也就是V600E 突變［8］,由于RAF 蛋白是MAPK 通路的激活介質(zhì),因此在正常生理?xiàng)l件下RAF 蛋白受到高度調(diào)節(jié)。在沒(méi)有細(xì)胞外有絲分裂信號(hào)的情況下,RAF 主要是細(xì)胞質(zhì)的,是多蛋白復(fù)合物的一部分,此突變可以讓BRAF 蛋白一直處于活化的、有激酶活性的狀態(tài),通過(guò)效應(yīng)蛋白突變導(dǎo)致的MAPK 信號(hào)通路失調(diào)在腫瘤轉(zhuǎn)化中起著至關(guān)重要的作用,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

惡性黑素瘤有種族傾向性,白種人發(fā)病率最高,以頭面部最為多見(jiàn),少見(jiàn)于肢端,黑種人則相反,發(fā)病率較低,肢端是最主要發(fā)病部位,黃種人的發(fā)病率則介于白種人和黑種人之間,一般認(rèn)為黃種人發(fā)生于肢端的惡性黑素瘤多見(jiàn),且多累及足部。作者對(duì)37 例肢端惡性黑素瘤和42 例非肢端惡性黑素瘤患者組織DNA 進(jìn)行測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)37 例肢端型患者中有7 例存在BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為18.92%,肢端型黑素瘤患者突變率較低,和土耳其一項(xiàng)研究結(jié)果17.1%突變率比較接近［9］,42 例非肢端型患者中有17 例發(fā)生BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為40.48%,未檢測(cè)出其他突變點(diǎn)和11 外顯子突變,和文獻(xiàn)報(bào)道的突變發(fā)生率接近［10］,80 例色素痣患者中檢測(cè)到5 例BRAF 基因的突變,表明中國(guó)漢族人非肢端惡性黑素瘤BRAF 基因突變率高于肢端惡性黑素瘤患者,但是在正常色素痣患者中也存在少量BRAF基因突變［11］。

BRAF 突變與惡性黑素瘤臨床表型的關(guān)系,報(bào)道不一。本研究顯示不同性別惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以50 歲為年齡界限,年輕黑素瘤患者BRAF 基因突變率較年長(zhǎng)患者有更高的突變率,可能和患者本身以及相關(guān)的環(huán)境等多種因素相關(guān),和既往研究結(jié)果相符合［12］。在病理特征上,BRAF 基因突變率和Breslow 厚度、潰瘍及臨床分期均有關(guān)。BRAF 基因突變患者,腫瘤浸潤(rùn)深度更深,因此有更厚的Breslow 厚度,由于腫瘤浸潤(rùn)的深度相對(duì)較深,因此腫瘤組織更加容易出現(xiàn)缺血壞死而導(dǎo)致潰瘍的發(fā)生,同樣,腫瘤較深的Breslow 厚度以及壞死和潰瘍,腫瘤細(xì)胞有更多的有絲分裂,其臨床分期也相對(duì)更差［13,14］。研究顯示,BRAF V600E 突變和腫瘤厚度增加、出現(xiàn)潰瘍以及患者的生存時(shí)間降低有關(guān),在多因素分析中,V600E 突變是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素［15］。因此,分析惡性黑素瘤患者臨床和病理特點(diǎn)與BRAF 突變的惡性行為的相關(guān)性,為臨床利用BRAF 突變檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤惡性程度,以及患者預(yù)后提供更加可靠的理論依據(jù),有BRAF 突變的患者同時(shí)也受益于該突變點(diǎn)［16］,針對(duì)腫瘤細(xì)胞的分子靶向治療以及靶向免疫治療等新型治療方法的出現(xiàn),BRAFV600E 突變的靶向藥物維羅菲尼(vemurafenib)和曲美替尼(trametinib)等相繼研制成功并先后得到美國(guó)食品及藥品管理局(FDA)的批準(zhǔn),用于晚期無(wú)法切除或轉(zhuǎn)移性黑素瘤的治療,使患者受益較大,這些分子靶向藥物的有效應(yīng)用以腫瘤細(xì)胞的BRAF 基因突變?yōu)榛A(chǔ),為黑素瘤患者帶來(lái)一定希望［17］。

綜上所述,本研究初步分析了中國(guó)漢族人肢端惡性黑色素瘤和非肢端惡性黑素瘤患者中BRAF 基因的突變情況,顯示中國(guó)人黑色素瘤患者中BRAF 突變?nèi)詾楦甙l(fā)突變,非肢端皮膚黑色素瘤中BRAF 基因突變高于肢端皮膚黑素瘤患者的突變。在這些突變中,BRAF 基因的V6OOE 突變是最主要類(lèi)型,這些初步研究為針對(duì)BRAF 基因突變的靶向藥物在中國(guó)黑色素瘤患者中的應(yīng)用提供了依據(jù)。