趙 旎，龍 燕

武漢大學(xué)：1.實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備管理處；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072

檢測(cè)微生物生長(zhǎng)速率是微生物學(xué)和微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的重要內(nèi)容，其在實(shí)際應(yīng)用中也非常廣泛，如耐藥菌株的鑒定、抗菌藥物的篩選等[1-2]。盡管目前實(shí)驗(yàn)教學(xué)中有多種檢測(cè)微生物生長(zhǎng)速率的實(shí)驗(yàn)方法[3]，如克隆形成法、比色法、MTT法，但是在實(shí)際運(yùn)用中均存在測(cè)定精度不高、實(shí)驗(yàn)成本高、實(shí)驗(yàn)時(shí)間冗長(zhǎng)、容易造成樣本污染等缺點(diǎn)[4-6]。因此，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件，找到一種適合所在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，既能提高實(shí)驗(yàn)精度，又能鍛煉學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能的可行性方案是非常有必要的。筆者在微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)踐中，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，以釀酒酵母為實(shí)驗(yàn)材料，比較全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀和多功能酶標(biāo)儀兩種檢測(cè)釀酒酵母生長(zhǎng)速率的實(shí)驗(yàn)方法，為本科生和研究生微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1材料 野生型酵母菌株和對(duì)照組酵母菌株(對(duì)衣霉素敏感菌株)為本實(shí)驗(yàn)室保存，酵母膏胨葡萄糖(YPD)平板和YPD液體培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[3]制備。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀(Bioscreen C，美國(guó))，多功能酶標(biāo)儀(BioTek SYNERGY H1，美國(guó))，恒溫?fù)u床(博訊，中國(guó))。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 提前2 d把低溫凍存的野生型酵母菌株、對(duì)照組酵母菌株通過(guò)劃線的方法接種在YPD平板上。實(shí)驗(yàn)前1天晚上再分別挑取單克隆劃線于新的YPD平板上。

1.3.2實(shí)驗(yàn)步驟 (1)在1.5 mL離心管中加入200 μL無(wú)菌雙蒸水。(2)用無(wú)菌槍頭在YPD平板上分別刮取適量酵母菌，放入步驟(1)的EP管中，充分混勻。(3)吸取50 μL步驟(2)中的酵母菌懸液，用1 mL無(wú)菌雙蒸水稀釋，分別取500 μL用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)600值。(4)用含有1.5 μmol衣霉素的液體YPD培養(yǎng)基把步驟(3)中的野生型酵母菌株、對(duì)照組酵母菌株分別稀釋成A600為0.1。(5)吸取步驟(4)中的酵母懸液分別放置于100孔培養(yǎng)板(用于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，液體體積為400 μL)和48孔培養(yǎng)板中(用于多功能酶標(biāo)儀，液體體積為600 μL)。(6)100孔培養(yǎng)板放置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中，全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的設(shè)定程序?yàn)椋?0 ℃，振蕩培養(yǎng)，每2 h自動(dòng)測(cè)定一次A600值，持續(xù)48 h[7-8]。(7)48孔培養(yǎng)板放置于30 ℃恒溫的水平搖床內(nèi)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，每間隔2 h將48孔培養(yǎng)板取出，放置于多功能酶標(biāo)儀中，測(cè)定A600值(每次充分搖勻)，測(cè)定時(shí)設(shè)定光程校正(自動(dòng)轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)1 cm的光程)。每次測(cè)定完畢，立刻放回恒溫水平搖床內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。(8)記錄、分析數(shù)據(jù)，在Excel中繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié) 果

2.1全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀檢測(cè)結(jié)果 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以A600值為縱坐標(biāo)，在Excel中繪制出生長(zhǎng)曲線,見(jiàn)圖1。野生型酵母菌株與對(duì)照組酵母菌株的生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)出典型的S型趨勢(shì)[9]。兩種菌株都在25 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在35 h左右達(dá)到平臺(tái)期。整體結(jié)果和預(yù)期一致,對(duì)照組酵母菌株的生長(zhǎng)速率低于野生型酵母菌株，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤。

2.2多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以A600值為縱坐標(biāo)，在Excel中繪制出生長(zhǎng)曲線圖，見(jiàn)圖2。野生型酵母菌株和對(duì)照組酵母菌株在15 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，盡管總體看來(lái)對(duì)照組酵母菌株的生長(zhǎng)速率低于野生型酵母菌株，但是兩條曲線的波動(dòng)較大，沒(méi)有呈現(xiàn)出典型的S型趨勢(shì)。特別是A600到達(dá)1.0之后，曲線呈現(xiàn)出波浪形，表明此時(shí)檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。

圖1 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀檢測(cè)生長(zhǎng)曲線圖

圖2 多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)生長(zhǎng)曲線圖

3 討 論

檢測(cè)微生物生長(zhǎng)速率是微生物學(xué)和微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中重要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床微生物檢驗(yàn)。涉及的實(shí)驗(yàn)方法主要為平板克隆形成法和生長(zhǎng)曲線法，但是這兩種方法均存在一定的不足[10-11]。如平板克隆形成法需要的時(shí)間較長(zhǎng)，以釀酒酵母實(shí)驗(yàn)為例，需要3 d，實(shí)驗(yàn)前期也需要實(shí)驗(yàn)者經(jīng)過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞濃度計(jì)算，如果細(xì)胞濃度測(cè)定、計(jì)算、稀釋出現(xiàn)偏差，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)板上克隆太密的情況，無(wú)法計(jì)數(shù)。且平板克隆形成法很難以生長(zhǎng)曲線的結(jié)果展示。生長(zhǎng)曲線法是目前實(shí)驗(yàn)教學(xué)中比較常用的方法。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通常把微生物培養(yǎng)在搖菌管中，每間隔一定時(shí)間，在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中取出等量的菌液，轉(zhuǎn)入比色皿中進(jìn)行A600值測(cè)定。此實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程較繁瑣，由于需要多次取樣，很容易造成樣本污染。

筆者在指導(dǎo)學(xué)生實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀法和多功能酶標(biāo)儀2種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)酵母菌株的生長(zhǎng)速率進(jìn)行檢測(cè)，這兩種方法均可以一次性檢測(cè)大量的實(shí)驗(yàn)樣本。結(jié)果顯示，全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀得出的生長(zhǎng)曲線非常完美，是典型的S型趨勢(shì)，可以觀察到遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期，沒(méi)有出現(xiàn)異常的數(shù)據(jù)波動(dòng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致。

多功能酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果盡管總體看來(lái)和預(yù)期一致，但是兩條曲線的波動(dòng)較大，特別是A600值到達(dá)1.0之后，曲線呈現(xiàn)出波浪形。導(dǎo)致這種波動(dòng)的原因可能是因?yàn)榻湍钢苯优囵B(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母菌液的濃度逐漸增大，酵母菌無(wú)法均勻分布在液體中，甚至出現(xiàn)不均一的沉淀，盡管每次用酶標(biāo)儀測(cè)定之前都會(huì)盡量搖勻48孔板，但是仍然無(wú)法保證菌液的均一性，導(dǎo)致A600值無(wú)法精確測(cè)出。筆者也發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到大約20 h的時(shí)候，48孔板中的菌液已經(jīng)變得非常濃稠，孔的底部聚集大量沉淀，不得不終止實(shí)驗(yàn)。而全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中的菌液在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到40 h之后，還比較均一，這可能與全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的振蕩培養(yǎng)方式有關(guān)。在繪制生長(zhǎng)曲線的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀整體數(shù)值要比多功能酶標(biāo)儀的數(shù)值偏低，這是因?yàn)槿詣?dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀在測(cè)量A600值的時(shí)候，不能設(shè)定光程校正，無(wú)法轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的1 cm光程，因此,測(cè)出的數(shù)值要低于多功能酶標(biāo)儀，但是這并不影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

為了盡可能減輕多功能酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)誤差，建議：(1)菌液的初始濃度可以相對(duì)降低，這樣酵母菌生長(zhǎng)的不會(huì)太快，不會(huì)在短時(shí)間內(nèi)形成大量的菌液沉淀。(2)在實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下，可以采用24孔板培養(yǎng)菌液，因?yàn)樵诳讖酱蟮膶?shí)驗(yàn)條件下，菌液在用酶標(biāo)儀測(cè)定之前比較容易混勻。(3)在搖勻培養(yǎng)板的時(shí)候，沿著“十”字的方向，水平均勻搖動(dòng)，幅度要小，避免菌液濺到培養(yǎng)板蓋子上。(4)培養(yǎng)板的空白孔里要添加無(wú)菌水，保持一定濕度，避免菌液蒸發(fā)。

本實(shí)驗(yàn)是結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，找到一種簡(jiǎn)單快捷測(cè)定微生物生長(zhǎng)速率的方法，特別是實(shí)時(shí)監(jiān)控液體培養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)速率。全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀檢測(cè)精度更高，無(wú)需專人值守，但是由于需要專業(yè)的設(shè)備，所以更適合于研究生開(kāi)展比較精密的創(chuàng)新性和探索性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。多功能酶標(biāo)儀則適合本科生開(kāi)展相對(duì)簡(jiǎn)單的定性實(shí)驗(yàn)，因?yàn)槎喙δ苊笜?biāo)儀法需要每間隔2～3 h用酶標(biāo)儀測(cè)量一次A值，需要耗費(fèi)相對(duì)較多的人工時(shí)間，因此可以同時(shí)進(jìn)行其他的實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生在連續(xù)的數(shù)據(jù)觀察和測(cè)定中，合理安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間，打下良好的科研實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。