朱舜華，李世寶,2△

1.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221000；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州 221000

巨細(xì)胞病毒(CMV)屬于皰疹病毒亞科,在宿主體內(nèi)具有很強(qiáng)的潛伏能力[1]。根據(jù)宿主感染的時(shí)間可以分為先天性感染和獲得性感染[2]。先天性感染主要是孕婦通過垂直途徑感染新生兒[3]，會(huì)引起新生兒小頭畸形，腦室腫大，肝脾腫大等疾病[4]。成人感染CMV一般無癥狀，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)可導(dǎo)致肺孢子菌肺炎等并發(fā)癥[5]。目前臨床檢測(cè)抗體的靈敏度與特異度低，實(shí)時(shí)熒光定量PCR因其在檢測(cè)中快速、高效特點(diǎn)在臨床被廣泛應(yīng)用[6]。根據(jù)CNAS-CL36醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明，實(shí)驗(yàn)室開展新項(xiàng)目前需對(duì)所采用的商業(yè)檢測(cè)試劑進(jìn)行方法學(xué)性能驗(yàn)證，主要包括精密度、檢出限、正確度、線性范圍等[7]。因此，本研究對(duì)上海之江生物的CMV核酸(CMV-DNA)試劑盒進(jìn)行性能驗(yàn)證，以期達(dá)到臨床檢測(cè)的要求。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 CMV-DNA標(biāo)本來自2020年6月1日徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科。

1.2儀器與試劑 SLAN-96P熒光定量PCR儀。CMV-DNA測(cè)定試劑盒(批號(hào)P20191201)、CMV-DNA陰性血清對(duì)照品和CMV-DNA臨界陽性對(duì)照品均購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取與PCR反應(yīng) 嚴(yán)格按照CMV-DNA測(cè)定試劑盒的要求進(jìn)行。37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min循環(huán)一次；然后93 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60 ℃。PCR結(jié)果判讀：儀器生成準(zhǔn)曲線后，會(huì)自動(dòng)顯示定量值。當(dāng)檢測(cè)樣本的檢測(cè)值在[(1.00E+03)～(1.00E+07)]copy/mL范圍時(shí)，測(cè)定結(jié)果有效。如果超過該范圍可將其稀釋后再進(jìn)行測(cè)量。

1.3.2性能驗(yàn)證指標(biāo)及驗(yàn)證方法

1.3.2.2檢出限 根據(jù)EP17-A文件的要求進(jìn)行檢測(cè)線驗(yàn)證時(shí)，至少測(cè)量20次。因此將已知結(jié)果的CMV陽性標(biāo)本，稀釋至試劑檢測(cè)下限(1.00E+03)copy/mL附近，對(duì)該標(biāo)本重復(fù)測(cè)量20次，進(jìn)行結(jié)果分析,可接受標(biāo)準(zhǔn)：陽性檢出率>95%。

1.3.2.3正確度 取20例已知測(cè)定結(jié)果的樣本，其測(cè)定濃度值范圍為[0～(1.50E+07)]copy/mL，使其分布于整個(gè)線性范圍內(nèi)。測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果進(jìn)行比較，繪制曲線。

1.3.2.4線性范圍 將7次方高濃度樣本進(jìn)行10倍梯度稀釋達(dá)到或接近試劑盒標(biāo)明的定量檢測(cè)限，進(jìn)行2次重復(fù)檢測(cè)。然后以測(cè)量值為X，理論值為Y繪制擬合曲線，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，R2≥0.980 0則符合要求。

2 結(jié) 果

2.1精密度 批內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果：高濃度樣本與低濃度樣本20次檢測(cè)結(jié)果其對(duì)數(shù)值的CV分別為1.64%、1.56%,見表1。批間精密度驗(yàn)證結(jié)果：高濃度與低濃度樣本分別測(cè)定5次，每次重復(fù)4次其對(duì)數(shù)值的CV分別為1.64%、1.56%，見表2。批間與批內(nèi)精密度CV值均小于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)5%，符合要求。

表1 CMV-DNA批內(nèi)精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

表2 CMV-DNA批間精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

續(xù)表2 CMV-DNA批間精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2檢出限 已知試劑盒的最低檢出限為(1.00E+03)copy/mL，將樣本稀釋到檢出限，重復(fù)測(cè)定20次，其陽性檢出率為100%，超過行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的95%，符合要求，見表3。

表3 CMV-DNA檢出限的評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3正確度 測(cè)定值與理論值的線性擬合方程為Y=0.984 1X+0.058 6，其R2為0.998 7符合要求，見圖1。

圖1 正確度線性結(jié)果

2.4線性范圍 將樣品濃度稀釋分布在試劑盒的線性范圍內(nèi)，繪制線性擬合方程為Y=1.004 9X+0.018 2，R2=0.999 9，見圖2。

圖2 梯度稀釋線性結(jié)果

3 討 論

目前，我國(guó)是CMV感染的高發(fā)區(qū)，人均感染率為85%左右[8]。在人體免疫功能正常時(shí)CMV處于潛伏期,當(dāng)人體免疫功能缺陷時(shí)，潛伏的病毒會(huì)大量增殖，所以，CMV感染是艾滋病患者的第二大機(jī)會(huì)性感染[9]。CMV感染也是常見的先天性感染，新生兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，感染CMV之后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果，如聽力損傷、神經(jīng)功能異常等[10]。因此，對(duì)CMV準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)顯得尤為重要。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)CMV檢出率高，克服了傳統(tǒng)PCR重復(fù)性差、易假陽性等缺點(diǎn)，在臨床得到了廣泛的應(yīng)用[11]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過檢測(cè)CMV-DNA載量來實(shí)現(xiàn)早期檢測(cè)，尤其是在CMV-IgM陰性時(shí)[12]。在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析時(shí)，需要將原始數(shù)據(jù)取對(duì)數(shù)再進(jìn)行分析，因?yàn)閷?shí)時(shí)熒光定量PCR原始數(shù)據(jù)成偏態(tài)分布，必須將其轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布才能進(jìn)行分析[13]。實(shí)驗(yàn)室需對(duì)試劑進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，確保試劑盒在本實(shí)驗(yàn)符合規(guī)定的要求。精密度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)應(yīng)放在其他實(shí)驗(yàn)之前，因?yàn)榫芏缺硎緶y(cè)量結(jié)果的再現(xiàn)性，是獲得良好準(zhǔn)確性的先決條件[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高濃度與低濃度樣本批內(nèi)與批間精密度的CV均小于5%，符合要求。

正確度為檢測(cè)結(jié)果均值與真值之間的一致程度，R2=0.998 7，說明測(cè)量值與理論值之間具有良好的一致程度，該試劑盒的正確度符合要求。將樣本稀釋在檢出限(1.00E+03)copy/mL附近，重復(fù)測(cè)量20次，檢出率為100%，這有利于提高臨床診斷的精準(zhǔn)。線性范圍關(guān)系到是否可以為臨床提供可靠的信息，線性范圍越寬則就越適用于臨床[15]。本實(shí)驗(yàn)所用試劑盒標(biāo)明的線性范圍為[(1.00E+03)～(1.00E+07)]copy/mL，但是本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所用的線性范圍為[(2.40E+03)～(2.26E+07)]copy/mL，最高濃度已經(jīng)超過試劑盒所規(guī)定，線性良好R2=0.999 9，證明結(jié)果可靠。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的CMV-DNA試劑盒精密度高,正確度好,檢出限可靠,具有良好的線性范圍，可以滿足臨床的需要。