張洪英，梁瑞，曹長(zhǎng)順，柯宗文，杜益茗，楊艷鳳，梁艷明

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州121000；2.錦州市中醫(yī)院，遼寧 錦州121000；3.錦州市中心醫(yī)院，遼寧 錦州121000）

卵巢早衰（premature overian failure,POF）是<40 歲女性因卵泡耗盡或停止發(fā)育所致卵巢功能減退到一定階段所呈現(xiàn)的疾病狀態(tài)[1]。導(dǎo)致POF的因素很多，如化療或放療、醫(yī)源性因素、遺傳變異、自身免疫性卵巢萎縮、各種環(huán)境因素（病毒、毒素和吸煙）等[2]。順鉑是目前應(yīng)用最為廣泛的化療藥物之一，能損傷卵巢功能結(jié)構(gòu)[3-4]，嚴(yán)重影響女性的身心健康。激素替代療法已成為治療POF 的首選方案，但也存在很大的致病風(fēng)險(xiǎn)。近年來由于化療藥物的廣泛應(yīng)用，使POF 的發(fā)病率逐年上升。對(duì)患有惡性腫瘤的育齡女性患者來說，化療損傷性腺功能，是導(dǎo)致POF 的一個(gè)重要原因。隨著惡性腫瘤育齡女性患者遠(yuǎn)期生存率的升高，為滿足這些患者的生育需求及提高其生活質(zhì)量，臨床需要尋找新的治療POF 的方法。葛根素是從葛根中提取的主要成分[5]，具有與植物雌激素大豆異黃酮相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)[6]，而且有抗凋亡的作用[7]。葛根素在治療POF的研究報(bào)道甚少。本研究應(yīng)用順鉑誘導(dǎo)復(fù)制小鼠卵巢早衰模型，探討葛根素對(duì)順鉑誘導(dǎo)小鼠卵巢早衰的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取30 只6 周齡雌性C57BL/6J小鼠，體重19～24 g，購自北京圍通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，1100111911080486。所有小鼠在SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，室溫20～23℃、濕度50%～65%，12 h/12 h 晝夜交替光照。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及實(shí)驗(yàn)組，每組10 只。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.1.2 藥物和試劑順鉑粉劑（購自美國Sigma 公司），葛根素注射液（購自成都天臺(tái)山制藥有限公司），Cleaved caspase-3 多克隆抗體、Bcl-2 多克隆抗體、Bax 多克隆抗體（購自美國Abcam 公司），山羊血清、過氧化氫、PBS、檸檬酸、檸檬酸鈉、熒光二抗、PI、抗熒光衰減封片劑（購自北京中山生物技術(shù)有限公司），小鼠E2、FSH、AMH 的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（購自江蘇酶標(biāo)生物公司），DAB 顯色試劑盒（購自上海碧云天生物公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器BT224S 電子秤、PB-21PH 儀（德國賽多利斯有限公司），LEICA-TP1020 全自動(dòng)脫水機(jī)、LEICA-EG-115OH 包埋機(jī)、低溫超速離心機(jī)（德國徠卡公司），SZX-7 體視顯微鏡、BX41 正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），酶標(biāo)儀（英國Biochrom Anthos 公司），光學(xué)顯微鏡（德國萊卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的復(fù)制小鼠給藥途徑均為腹腔注射。模型組先給予9 d 生理鹽水（4.0 ml/kg），再給予5 d 順鉑（4.5 mg/kg）及生理鹽水（4.0 ml/kg）。實(shí)驗(yàn)組先給予9 d 葛根素（200.0 mg/kg），再給予5 d葛根素（200.0 mg/kg）及順鉑（4.5 mg/kg）。對(duì)照組給予同體積生理鹽水14 d。實(shí)驗(yàn)第9 天時(shí)，稱重小鼠并記錄，觀察小鼠的活動(dòng)、飲食及皮毛光澤度。實(shí)驗(yàn)第15 天脫頸處死所有小鼠，迅速心尖取血，3 000 r/min 離心15 min，取上清液待測(cè)。將小鼠卵巢標(biāo)本放入Davision's 溶液中固定24 h，待石蠟包埋切片。

1.2.2 小鼠陰道涂片每天觀察3 組小鼠的飲食、活動(dòng)及皮毛變化等情況，每天8:00 將10 μl 生理鹽水注入小鼠陰道內(nèi)，反復(fù)沖洗3 次后用消毒棉簽插入小鼠陰道約0.4 cm，輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)取出分泌物后置于載玻片上，亞甲藍(lán)染色，觀察結(jié)果。

1.2.3 ELISA 法檢測(cè)E2、FSH 及AMH 水平ELISA試劑盒室溫平衡30 min。血清標(biāo)本置冰上溶解30 min。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，分別設(shè)置空白、標(biāo)準(zhǔn)、待檢樣品3 個(gè)孔，加樣，37℃溫育30 min，洗滌后加入酶標(biāo)試劑50 μl，溫育，依次加顯色液A、B，37℃顯色10 min，滴加終止液，加入終止液的15 min內(nèi)在酶標(biāo)儀450 nm 處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值及濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各樣品的濃度。

1.2.4 小鼠卵巢組織石蠟切片制備及HE 染色室溫下，固定好的卵巢組織放入組織盒內(nèi)水洗，置于脫水機(jī)中，梯度酒精脫水及二甲苯透明，浸蠟，置入包埋框中，放平其底部，倒入液體石蠟，制成卵巢石蠟組織塊。石蠟組織切片，厚度為5 μm。切片在53℃溫水中展開，平整貼附在載玻片上，60℃烤片機(jī)烤片3 h，脫蠟水化，蘇木精染色，分化反藍(lán)處理，伊紅染色，PBS 水洗，脫水透明封片，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.5 免疫熒光染色卵巢石蠟組織切片60℃烤片機(jī)烤片45 min，常規(guī)二甲苯及梯度酒精脫蠟至水，PBST 水洗3 次，每次5 min，抗原修復(fù)（98℃檸檬酸鈉抗原修復(fù)液處理10 min），自然冷卻20 min，加速冷卻至室溫，10%山羊血清室溫封閉60 min，滴加一抗（1∶200）置于濕盒中，4℃冰箱孵育過夜，取出濕盒恢復(fù)至室溫，滴加二抗室溫避光孵育30 min，PBST水洗3 次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅劑，蓋好蓋玻片，應(yīng)用熒光顯微鏡激發(fā)光460～550 nm 激發(fā)出綠色熒光圖，激發(fā)光530～550 nm 激發(fā)出紅色熒光圖，取圖并分析結(jié)果。

1.2.6 western blotting法檢測(cè)Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量將細(xì)胞裂解液RIPA 加入各組卵巢組織，置于冰面裂解30 min，卵巢組織經(jīng)研磨后吸出1.5 ml 置于EP 管，5 000 r/min 離心5 min，吸出1.5 ml 上清液，用BCA 法測(cè)定卵巢組織中蛋白濃度，根據(jù)SDS-PAGE 試劑盒制膠，電泳，將膠片上的蛋白濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，將轉(zhuǎn)印膜置于1% BSA 中，室溫封閉2 h，加一抗稀釋液Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax（濃度為1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔的二抗，室溫中孵育1 h，采用底物化學(xué)發(fā)光ECL 法顯影，β-actin 為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重量復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況

正常組小鼠的毛光亮、動(dòng)作靈敏、活躍、攝食頻繁，對(duì)外界刺激的反應(yīng)性良好。模型組小鼠毛色澤暗淡、活動(dòng)少、攝食少、對(duì)外界刺激的反應(yīng)性差。實(shí)驗(yàn)組小鼠毛的光澤度、活動(dòng)、攝食對(duì)外界刺激的反應(yīng)性及靈活性相對(duì)模型組有改善。

2.1.1 小鼠體重變化實(shí)驗(yàn)第10 天、第11 天、第12 天、第13 天、第14 天3 組小鼠體重比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的體重有差異（F=397.937，P=0.000）；②3 組小鼠的體重有差異（F=16.386，P=0.000）；③3 組小鼠體重的變化趨勢(shì)有差異（F=546.834，P=0.000），模型組與對(duì)照組相比體重呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組與模型組相比小鼠體重下降更加平緩。見表1和圖1。

圖1 3組小鼠體重隨時(shí)間變化趨勢(shì)

表1 3組小鼠體重比較（n=10，g，±s）

表1 3組小鼠體重比較（n=10，g，±s）

組別對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組第10天21.16±0.84 22.24±1.48 23.18±0.70第11天21.22±0.85 20.92±1.33 22.66±0.67第12天21.24±0.79 19.18±1.38 21.80±0.69第13天21.32±0.73 18.00±1.17 21.20±0.53第14天21.52±0.68 16.56±1.06 21.32±0.63第15天21.54±0.72 15.66±1.02 20.68±0.59

2.1.2 動(dòng)情周期觀察正常小鼠動(dòng)情周期（4～6 d）分為4 個(gè)階段，各個(gè)時(shí)期陰道脫落細(xì)胞的變化為：①動(dòng)情前期見大量的有核上皮細(xì)胞和少量的角化細(xì)胞，無白細(xì)胞；②動(dòng)情期可見滿視野的無核角化上皮細(xì)胞和少量有核上皮細(xì)胞；③動(dòng)情后期有大量的白細(xì)胞出現(xiàn)，見少量的有核上皮細(xì)胞；④動(dòng)情間期則出現(xiàn)大量的白細(xì)胞（見圖2）。實(shí)驗(yàn)過程中通過陰道分泌物涂片發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組有正常的動(dòng)情周期，動(dòng)情周期較為規(guī)則。3 組的動(dòng)情間期構(gòu)成比（動(dòng)情間期與總動(dòng)情周期的比值）分別為對(duì)照組（36.33±0.09）%，模型組（76.62±0.08）%，實(shí)驗(yàn)組（58.33±0.08）%，3 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.955，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，模型組小鼠動(dòng)情間期構(gòu)成比高于對(duì)照組（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組小鼠動(dòng)情間期構(gòu)成比低于模型組（P<0.05）（見圖3）。

圖2 正常小鼠動(dòng)情周期4個(gè)時(shí)期的陰道圖（亞甲藍(lán)染色×400）

圖3 3組小鼠動(dòng)情間期構(gòu)成比比較（n=10，±s）

2.2 3組小鼠血清E2、AMH、FSH水平比較

3 組小鼠血清E2、AMH 和FSH 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清E2 和AMH 水平降低，F(xiàn)SH 水平升高（P<0.05）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清E2 和AMH水平升高，F(xiàn)SH水平降低（P<0.05）。見表2。

表2 3組小鼠血清激素水平比較（n=10，±s）

表2 3組小鼠血清激素水平比較（n=10，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組F 值P 值FSH/（Pg/ml）2.59±0.12 3.60±0.04①3.12±0.04②180.365 0.000 E2/（pmol/L）117.79±2.81 74.55±2.81①98.00±6.24②100.131 0.000 AMH/（mlU/ml）40.01±0.69 23.70±2.09①65.38±3.15②358.040 0.000

2.3 3組小鼠卵巢組織形態(tài)

對(duì)照組可見不同發(fā)育階段的卵泡，成熟卵泡處于卵巢的邊緣，顆粒細(xì)胞規(guī)則排列，有時(shí)呈現(xiàn)放射狀；模型組的卵巢間質(zhì)出現(xiàn)纖維化改變，卵泡閉鎖，卵泡顆粒細(xì)胞減少、排列紊亂，甚至消失、轉(zhuǎn)化為結(jié)締組織細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組可見閉鎖卵泡很少，成熟卵泡處于卵巢邊緣，顆粒細(xì)胞有序排列并且數(shù)目多。見圖4。

圖4 3組小鼠卵巢組織形態(tài)（HE染色）

2.4 3 組小鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 在3 組小鼠卵巢組織中均有表達(dá)，且以顆粒細(xì)胞為主。見圖5。

圖5 3組小鼠卵巢Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)（免疫熒光染色×200）

2.5 3 組小鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 組小鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，模型組與對(duì)照組比較，卵巢組織細(xì)胞Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量減少，Bax、Cleaved caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量增加（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，卵巢組織Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，Bax、Cleaved caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量減少（P<0.05）。見圖6和表3。

表3 3組小鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，±s）

表3 3組小鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組F 值P 值Cleaved-caspase-3 96.07±4.18 139.99±2.77①113.71±5.32②82.301 0.000 B cl-2 96.52±1.33 55.95±1.75①89.18±2.11②452.710 0.000 Bax 46.42±2.13 100.21±1.22①63.94±2.54②542.075 0.000

圖6 3組小鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

POF 是早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）的最后階段。近年來化療藥物的廣泛應(yīng)用是POF發(fā)病率逐年提升的主要因素[8]。卵巢由含有大量卵泡的皮質(zhì)和髓質(zhì)構(gòu)成，成熟卵泡位于卵巢邊緣。卵泡是由卵母細(xì)胞及其周圍排列規(guī)則、具有分泌雌激素功能的顆粒細(xì)胞等結(jié)構(gòu)組成。POF 的特點(diǎn)是垂體分泌的FSH 水平升高，雌激素不足[9-11]。POF 主要臨床表現(xiàn)有月經(jīng)量減少、生育率低，潮熱多汗、神經(jīng)質(zhì)、性欲減退，此外還有心腦血管疾病及骨質(zhì)疏松、泌尿生殖道萎縮、抑郁癥等風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重者有自殺傾向[12]。POF 的治療方法很多，如激素替代治療、免疫療法、低溫保卵技術(shù)及卵巢移植、心理治療、干細(xì)胞治療、基因治療、中藥及天然植物提取物治療。激素替代治療可以改善POF 女性的潮熱及陰道和泌尿系統(tǒng)癥狀，有助于保持骨骼健康，減少骨質(zhì)疏松的機(jī)會(huì)，還可預(yù)防心臟病[13]，但是存在很大的患病風(fēng)險(xiǎn)如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及靜脈血栓栓塞等[14-16]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）對(duì)恢復(fù)順鉑引起POF 中的受損卵巢起重要作用[17]，還可以在化療引起的POF 小鼠模型中恢復(fù)卵巢激素的產(chǎn)生并重新激活卵泡形成[18]。POF 的治療方法很多，但尚無長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床的方法。

有研究通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了葛根素可以競(jìng)爭(zhēng)E2 受體，抑制雌激素發(fā)生作用，從而在子宮內(nèi)膜異位癥中起調(diào)控作用[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠毛色澤暗淡、活動(dòng)少、攝食少、對(duì)外界刺激的反應(yīng)性差，體重下降明顯，動(dòng)情間期延長(zhǎng)。雖然實(shí)驗(yàn)組的E2 水平相對(duì)于模型組增加，但并不能證明葛根素有改善卵巢功能的作用。隨之檢測(cè)小鼠血清FSH、AMH 水平，結(jié)果顯示，相較于模型組，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清FSH 水平降低，AMH 水平升高，這表示模型復(fù)制成功，同時(shí)表明，葛根素可以改善順鉑損傷的卵巢功能。小鼠卵巢組織切片HE 染色結(jié)果顯示，相對(duì)于模型組，實(shí)驗(yàn)組可見閉鎖卵泡少，成熟卵泡位于卵巢周圍，顆粒細(xì)胞排列有序且數(shù)目多，這通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明葛根素對(duì)順鉑損傷的小鼠卵巢結(jié)構(gòu)及功能具有保護(hù)作用。

凋亡是通過清除機(jī)體內(nèi)病變細(xì)胞來維持正常組織生長(zhǎng)的一種重要的程序性細(xì)胞死亡[20]。凋亡途徑的失調(diào)是導(dǎo)致人類疾病的重要因素。Bax 是Bcl-2 家族中重要組成部分，它包含BH1、BH2、BH33 個(gè)結(jié)構(gòu)域，并能誘導(dǎo)線粒體外膜釋放細(xì)胞色素?，導(dǎo)致Caspase 家族的激活引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21-22]。Bcl-2 家族抗凋亡蛋白包括的Bcl-2 和Bcl-X，可以通過阻止細(xì)胞色素C 的釋放，從而抑制凋亡發(fā)生[23-24]。YU 等[7]通過體外實(shí)驗(yàn)證明葛根素可以通過調(diào)控Bax 和Bcl-2 的活性來抑制細(xì)胞色素C 的釋放和Cleaved caspase-3 的降解，來抑制hFOB1.19 細(xì)胞的凋亡。YUAN 等[24]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)葛根素通過抑制NF-κB 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而下調(diào)Bax 及上調(diào)Bcl-2，對(duì)LPS 誘導(dǎo)的H9c2 心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。有研究指出在體外實(shí)驗(yàn)中葛根素對(duì)于卵巢顆粒細(xì)胞具有保護(hù)作用[25-26]。本研究免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 在3 組小鼠卵巢組織中均有表達(dá)，且以顆粒細(xì)胞為主。Western blotting 法檢測(cè)Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，模型組與對(duì)照組相比，卵巢組織細(xì)胞中Bax、Cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量減少；實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，卵巢組織細(xì)胞中Bax、Cleaved caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量減少，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量增加。因?yàn)槁殉灿蓽\層的皮質(zhì)和深層髓質(zhì)構(gòu)成，皮質(zhì)占大多數(shù)，并且被大量的卵泡所占據(jù)，卵泡主要是由卵母細(xì)胞及其周圍的顆粒細(xì)胞構(gòu)成，結(jié)果表明凋亡蛋白大多數(shù)表達(dá)在顆粒細(xì)胞中。CHENG 等[19]通過免疫組織化學(xué)及免疫蛋白印記等技術(shù)發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)的小鼠POF 模型中，顆粒細(xì)胞異常凋亡，小鼠卵巢組織細(xì)胞Bax 上調(diào)，Bcl-2 下調(diào)。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果一致。

綜上所述，順鉑可導(dǎo)致小鼠卵巢組織細(xì)胞凋亡，以顆粒細(xì)胞為主，引起卵巢功能減退。葛根素能抑制卵巢組織細(xì)胞凋亡，恢復(fù)卵巢功能，改善POF 小鼠的一般活動(dòng)及狀態(tài)。葛根素對(duì)順鉑損傷的小鼠卵巢結(jié)構(gòu)及功能均有保護(hù)作用，為臨床治療化療引起的POF 提供新的治療思路，同時(shí)為完善葛根素的臨床應(yīng)用提供參考。