張守花，張新海，劉延奇，秦令祥

（1.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鶴壁 458030；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.漯河市食品研究院有限公司，河南 漯河 462300）

莼菜（Brasenia schreberi），別稱馬蹄菜、水葵等，屬睡蓮科的莼屬，多年生水生宿根草本植物[1]，廣泛分布于東亞、大洋洲、西非和北美地區(qū)。莼菜是一種珍貴的水生蔬菜，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素等，具有良好的食用和藥用價(jià)值[2-3]。莼菜具有清熱補(bǔ)血、潤(rùn)肺解毒、利尿消腫、健胃促消化、止瀉止嘔、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降三高、抗衰老等功效[4-5]，對(duì)胃潰瘍、腫痛、黃疸和熱痢等有治療作用[6-8]，有“水中人參”、“美容佳蔬”和“抗癌佳品”之稱[9]。莼菜多糖（Brasenia schreberi polysaccharide，BSP）是莼菜中含有的一種重要的生物活性成分，具有提高免疫力和改善亞健康的作用[10-11]。

目前，植物多糖的提取主要有熱水浸提、酶解[12]、微波輔助、超聲波輔助[13]和微波協(xié)同酶解[14]等方法，這些方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。高壓脈沖電場(chǎng)（high intensity pulsed electric fields，HPEP）是一種新興的現(xiàn)代高新提取技術(shù)，其原理是利用瞬間脈沖高壓破壁植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞膜電位混亂，使其可逆或不可逆破裂，促進(jìn)極性分子在細(xì)胞內(nèi)定向排列，功效成分溶出。該技術(shù)具有非熱性傳遞均勻、效率高、能耗低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物功能成分的提取[15-19]。酶解法是利用酶破壞細(xì)胞壁，溶出功效成分。高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶技術(shù)是一種新型、先進(jìn)的天然產(chǎn)物提取技術(shù)，具有提取率高、提取溫度低、提取時(shí)間短、能耗低、對(duì)活性成分損傷小等優(yōu)點(diǎn)[20-21]。然而，高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究采用高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，以期提高BSP提取率，為后續(xù)BSP的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莼菜（人工種植）：蘇州東山東湖莼菜廠；纖維素酶（20 000 U/g）：河北利華生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：陜西源優(yōu)生物科技有限公司；果膠酶（20 000 U/g）：北京藍(lán)博斯特生物有限公司；硫酸、無(wú)水乙醇、葡萄糖、苯酚、氫氧化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DE-100型高精度雙極高壓靜電場(chǎng)發(fā)生器：寧波新芝生物科技有限公司；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海耀特儀器設(shè)備有限公司；760CRT紫外-可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；PE-28酸度計(jì)：北京梅特勒-托利多儀器有限公司；D2015W電動(dòng)攪拌器：上海梅穎浦儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 莼菜粉的制備

將莼菜經(jīng)氫氧化鈉溶液脫去體外膠質(zhì)后，再用清水淋洗，熱風(fēng)干燥，勻漿機(jī)剪切制得莼菜粉，備用。

1.3.2 BSP的提取

莼菜粉→按比例加水?dāng)嚢杈鶆颉邏好}沖電場(chǎng)提取→取出調(diào)節(jié)pH值（檸檬酸和磷酸氫二鈉緩沖液）→復(fù)合酶法提取→提取液Sevag法[22]脫蛋白→離心（5 000 r/min，10 min）→上清液減壓濃縮→加乙醇沉淀（3倍體積95%乙醇）→靜置（放入4℃冰箱，靜置24h）→離心（5 000 r/min，10 min）→真空冷凍干燥→莼菜粗多糖。

1.3.3 BSP測(cè)定

BSP測(cè)定采用苯酚-硫酸法[23]。

1.3.4 BSP提取率計(jì)算

BSP提取率計(jì)算公式如下。

1.3.5 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5.1 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按1.3.2的方法，稱取10 g莼菜粉5份進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP，研究不同因素對(duì)BSP提取率的影響。固定條件：料液比 1∶30（g/mL），電場(chǎng)強(qiáng)度 20 kV/cm，脈沖數(shù)8，提取時(shí)間30 min。分別設(shè)定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），電場(chǎng)強(qiáng)度為 10、15、20、25、30 kV/cm，脈沖數(shù)為 2、4、6、8、10，提取時(shí)間為10、20、30、40、50 min，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每組重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.5.2 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取表1列出的4個(gè)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor levels of orthogonal experimental design

1.3.6 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.6.1 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)提取后，再按1.3.2的方法稱取10 g莼菜粉5份耦合復(fù)合酶法提取BSP，研究不同因素對(duì)BSP提取率的影響。固定條件：復(fù)合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶質(zhì)量比為1∶1∶1）添加量 2.5%，酶解pH4.5，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間50 min。分別設(shè)定復(fù)合酶添加量1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，酶解pH3.0、3.5、4.0、4.5 和 5.0，酶解溫度 30、40、50、60、70℃，酶解時(shí)間 20、30、40、50、60 min，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6.2 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取表2列出的4個(gè)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factor levels table of orthogonal experimental design

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行測(cè)定的結(jié)果的平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel整理，采用正交設(shè)計(jì)助手進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP工藝條件優(yōu)化

2.1.1 料液比對(duì)BSP提取率的影響

料液比對(duì)BSP提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)BSP提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the BSP extraction rate

由圖1可知，BSP提取率隨著溶劑用量的增加先升高后趨于平緩。這是因?yàn)槿軇┯昧吭黾?，莼菜?xì)胞與其接觸面之間的濃度差增大，促進(jìn)了多糖的浸出，提取率升高。但當(dāng)溶劑用量達(dá)到一定值時(shí)，多糖基本完全被溶出，提取率不再顯著升高，而趨于穩(wěn)定。這與代名君等[24]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此，料液比1∶30（g/mL）為佳。

2.1.2 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)BSP提取率的影響

電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)BSP提取率的影響見圖2。

圖2 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)BSP提取率的影響Fig.2 Effect of electric field intensity on the BSP extraction rate

由圖2可知，BSP提取率隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加先升高再降低。這是因?yàn)殡妶?chǎng)強(qiáng)度增加，莼菜細(xì)胞破壞增多，極性溶劑運(yùn)動(dòng)加快，進(jìn)入細(xì)胞的溶劑增多，多糖溶出更易，提取率升高。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度≥20 kV/cm時(shí)，過大的電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)使多糖降解，提取率降低。這與Wang Ke等[25]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此，電場(chǎng)強(qiáng)度20kV/cm為佳。

2.1.3 脈沖數(shù)對(duì)BSP提取率的影響

脈沖數(shù)對(duì)BSP提取率的影響見圖3。

圖3 脈沖數(shù)對(duì)BSP提取率的影響Fig.3 Effect of the number of pulses on the BSP extraction rate

由圖3可知，BSP提取率隨著脈沖數(shù)的增加先升高再降低。這是因?yàn)槊}沖次數(shù)增加，電場(chǎng)作用于提取液的程度和頻率增加，莼菜細(xì)胞破壞的程度和數(shù)量增加，提取率升高。當(dāng)脈沖數(shù)≥8時(shí)，過大的電場(chǎng)和脈沖頻率增強(qiáng)了多糖的電解，促使多糖部分降解，提取率降低。這與Zhou Yajun等[26]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此，脈沖數(shù)8為佳。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the BSP extraction rate

由圖4可知，BSP提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低。這是因?yàn)樘崛r(shí)間增加，高壓電場(chǎng)作用程度增加，細(xì)胞破裂程度和數(shù)量增多，提取率升高。當(dāng)提取時(shí)間≥30 min時(shí)，細(xì)胞基本完全破裂，再繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多糖結(jié)構(gòu)會(huì)部分被破壞，提取率降低。這與周亞軍等[27]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此，提取時(shí)間30 min為佳。

2.1.5 高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP正交試驗(yàn)結(jié)果

高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of orthogonal experimental design

高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的方差分析結(jié)果見表4。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The variance analysis results

由表3、表4結(jié)果分析可知，各因素影響關(guān)系為：A＞D＞B＞C。料液比和提取時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響較大，達(dá)到顯著水平，其它不顯著。通過k值的分析，其最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶30（g/mL），提取時(shí)間40 min，電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm，脈沖數(shù)6。在上述最佳條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，平行驗(yàn)證3次，BSP提取率為10.75%（3次平均值）。

2.2 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP工藝條件的優(yōu)化

在高壓脈沖電場(chǎng)提取BSP的最佳工藝條件下，再進(jìn)一步耦合復(fù)合酶法提取BSP。

2.2.1 復(fù)合酶添加量對(duì)BSP提取率的影響

復(fù)合酶添加量對(duì)BSP提取率的影響見圖5。

圖5 復(fù)合酶添加量對(duì)BSP提取率的影響Fig.5 Effect of compound enzyme addition on the BSP extraction rate

由圖5可知，BSP提取率隨復(fù)合酶添加量的增加先升高再趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)椋柑砑恿康脑黾?，加大了與底物接觸面積，酶解更充分，多糖溶出增多，提取率升高。當(dāng)復(fù)合酶添加量≥2.5%時(shí)，酶解反應(yīng)基本完全，再繼續(xù)增加添加量，多糖提取率也不會(huì)顯著變化而是趨于穩(wěn)定。HUYNH等[28]的研究也表明酶添加量過多，酶解已完全，對(duì)提取率影響不明顯而趨于穩(wěn)定。因此，復(fù)合酶添加量2.5%為佳。

2.2.2 酶解pH值對(duì)BSP提取率的影響

酶解pH值對(duì)BSP提取率的影響見圖6。

圖6 酶解pH值對(duì)BSP提取率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis pH value on the BSP extraction rate

由圖6可知，BSP提取率隨著酶解pH值的增大呈先升高再降低的趨勢(shì)。這是因?yàn)?，pH值是影響酶活性的重要因素之一，酶解反應(yīng)在最適宜pH值時(shí)，酶活性最高，酶解最充分，提取率也最高，反之提取率降低。這與孟利娜等[29]的研究結(jié)果趨勢(shì)相似。因此，酶解pH值為4.5最佳。

2.2.3 酶解溫度對(duì)BSP提取率的影響

酶解溫度對(duì)BSP提取率的影響見圖7。

圖7 酶解溫度對(duì)BSP提取率的影響Fig.7 Effect of enzymolysis temperature on the BSP extraction rate

由圖7可知，BSP提取率隨著酶解溫度的升高呈先升高再降低的趨勢(shì)。這是因?yàn)槊附鉁囟壬撸富钚栽鰪?qiáng)，酶解反應(yīng)加快，多糖溶出增多，提取率升高；當(dāng)酶解溫度≥50℃后，酶活性開始降低，再繼續(xù)增加酶解溫度，部分酶會(huì)失去活性，提取率降低。這與李曉等[30]的研究結(jié)果趨勢(shì)基本一致。因此，酶解溫度50℃最佳。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響見圖8。

圖8 酶解時(shí)間對(duì)BSP提取率的影響Fig.8 Effect of enzymolysis time on the BSP extraction rate

由圖8可知，BSP提取率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)先升高再趨于平緩。這是因?yàn)?，酶解時(shí)間過短，酶解程度較低，酶解不充分，多糖溶出不多；而酶解時(shí)間達(dá)到最佳時(shí)間后，酶解已經(jīng)完全，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，提取率也不會(huì)明顯升高而趨于平緩。這與Sowbhagya等[31]的研究結(jié)果趨勢(shì)基本相似。因此，酶解時(shí)間50 min最佳。

2.2.5 高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP正交試驗(yàn)結(jié)果

高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of orthogonal experimental design

高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的方差分析結(jié)果見表6。

表6 方差分析結(jié)果Table 6 The variance analysis results

由表5、表6結(jié)果分析可知，各因素的影響順序?yàn)椋篍＞F＞H＞G，復(fù)合酶添加量和酶解pH值對(duì)BSP提取率的影響較大，達(dá)到了顯著水平，其它不顯著。通過對(duì)k值的分析，高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP的最佳工藝參數(shù)為：E2F2G1H3，即復(fù)合酶添加量2.5%，酶解pH值4.5，酶解時(shí)間60 min，酶解溫度40℃。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行驗(yàn)證3次，得到BSP提取率為12.27%（3次平均值）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)為了比較單一提取方法提取BSP和復(fù)合提取方法提取BSP的不同，試驗(yàn)先進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)法提取BSP，再進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：料液比 1∶30（g/mL），提取時(shí)間 40 min，電場(chǎng)強(qiáng)度 25 kV/cm，脈沖數(shù)6；然后再耦合復(fù)合酶法提取，復(fù)合酶添加量2.5%，酶解pH值4.5，酶解時(shí)間60 min，酶解溫度40℃，該條件下，BSP提取率為12.27%。本試驗(yàn)所用的高壓脈沖電場(chǎng)耦合復(fù)合酶法提取BSP，與單一的高壓脈沖電場(chǎng)提取相比，其提取率明顯提高，是一種新的提取BSP的方法，為后續(xù)BSP的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。