鄒妍，胡家強，王津，劉爽，王碩

（南開大學醫(yī)學院天津市食品科學與健康重點實驗室，天津 300350）

茶葉的種植起源于中國，最早的人工種植茶葉距今已6 000多年。隨著歷史的演進，茶葉的種植與飲用逐漸得到發(fā)展與傳播，并漸漸形成獨特的茶文化，聞名于海內(nèi)外各國。發(fā)展至今，茶葉的品種越來越多，目前已有數(shù)百種。人們越來越關(guān)注自己的健康，茶飲品也趁勢風靡各地。短短幾年，各類的茶飲品先后出現(xiàn)，使得人們對茶的研究又產(chǎn)生了新的興趣。茶葉有著豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如茶多糖、茶多酚、葉酸、茶氨酸、咖啡堿等，可以促進人體的健康，增強機體免疫力，具有廣闊的發(fā)展前景。在烘焙產(chǎn)品、飲料中添加一定量的茶葉粉，既可以賦予食品獨特的清新風味，又增加營養(yǎng)價值，具有社會經(jīng)濟及營養(yǎng)健康的多方面意義。

人們在飲茶時通常傾向于選擇嫩茶，認為嫩茶是較高品質(zhì)的茶，而老茶口感風味較差[1]。事實上，老茶對健康起到的作用同樣不容忽視。研究表明，粗老茶中含有較多的茶多糖、茶多酚等益生成分，對糖尿病等代謝疾病有緩解作用[2]，而豐富的膳食纖維也可以調(diào)節(jié)腸道菌群的動態(tài)平衡。因此了解嫩茶、中等嫩茶和老茶中各益生成分的含量，以及對人體腸道健康的不同作用，對于茶葉的綜合利用，以及人們對茶葉的選擇，有較為實際的意義。

茶多酚在人體胃腸道中主要被利用部位是結(jié)腸部分，結(jié)腸微生物可以將多酚類化合物轉(zhuǎn)化為具有生物活性的物質(zhì)，從而影響腸道的生態(tài)環(huán)境，促進乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的增長，抑制幽門螺桿菌的有害菌產(chǎn)生毒素，進而改變腸道菌群組成[3-5]。茶多糖是茶葉中重要的生物活性物質(zhì)，在不同時期的茶葉中含量不同。Chen等[6]以茯磚紅茶為原料，發(fā)現(xiàn)茶多糖可以被大腸菌群分解利用，顯著調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和豐度。膳食纖維被稱為“第七大營養(yǎng)素”，王津等[7]通過體外發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn)，茶葉膳食纖維可顯著增加乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量，對腸道中的腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等條件致病菌和有害菌有一定的抑制作用。氨基酸是人體腸道中最先被利用的營養(yǎng)物質(zhì)之一，它在腸道中可以被代謝產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），而SCFAs對腸道菌群有著重要影響，因而茶葉中的氨基酸對人體腸道菌群也有著直接或間接的影響[8]。

如果要研究茶葉的主要成分對人體腸道菌群的作用，那么則需要采集口腔、胃和小腸中的代謝成分以及腸道中的菌群樣品。但是這些操作真正在人類身上是無法實現(xiàn)的，即使用小鼠代替，其成本和操作量也非常大。在這種情況下，針對腸道微生物的體外發(fā)酵模型便應(yīng)運而生，其對推動腸道微生態(tài)學、人體和動物營養(yǎng)學的發(fā)展具有非凡意義。Minekus等[9]基于生理相關(guān)條件提出了一種通用的標準化靜態(tài)消化方法，概述了包括口腔、胃和小腸消化在內(nèi)的參數(shù)框架下的體外發(fā)酵，為后來者構(gòu)建體外發(fā)酵模型提供了依據(jù)。

本研究測定嫩茶、中等嫩茶及老茶中的各項基本成分含量，利用高效液相色譜法對3種時期的茶葉粉的茶多酚及兒茶素單體的含量進行量化，利用蒽酮-硫酸法測定3種時期的茶葉粉的茶多糖含量，利用茚三酮比色法對茶氨酸含量進行測定，利用堿提醇沉法對3種時期的茶葉粉的膳食纖維含量進行測定，在體外發(fā)酵試驗中對人的胃腸道系統(tǒng)進行模擬，從而探究茶葉粉對人體腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、乙二胺四乙酸二鈉、茚三酮溶液、硅藻土、2-（N-嗎啉）乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate，MES）、三羥甲基氨基甲烷（trometamol，TRIS）：SIGMA-ALDRICH公司；抗壞血酸、乳酸細菌瓊脂培養(yǎng)基、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基：上海恒斐生物科技有限公司；福林酚：上海源葉生物科技有限公司；Megazyme總膳食纖維檢測試劑盒：上海甄準生物科技有限公司；蒽酮：北京凱瑞基生物科技有限公司；疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂、LBS瓊脂：北京諾博萊德科技有限公司。采用試劑均為生化級試劑。

3種不同采收時期的茶葉粉由杭州產(chǎn)的綠茶烘干碾碎加工而成。采收晚而成熟的茶，茶葉較少，梗較多，為老茶；芽與葉的比例高，一個芽和一到兩片葉子結(jié)合在一起的，為嫩茶；中等嫩茶介于兩者之間。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2489高效液相色譜儀：廣州逸?？萍加邢薰荆籌nfinite M200 PRO酶標儀：瑞士帝肯公司；HERAcell 150i（銅內(nèi)膽）CO2培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶葉粉益生成分含量檢測

采用GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》的方法測定茶游離氨基酸含量。茶氨酸含量采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定，色譜條件參考GB/T 23193—2017《茶葉中茶氨酸的測定高效液相色譜法》中的方法。茶多酚的測定方法為GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中的福林酚法，各個兒茶素單體采用HPLC法測定，色譜條件參考馬慧等[10]的方法。茶葉中總膳食纖維、可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維采用試劑盒測定。膳食纖維化學成分中，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠的含量測定參照董文成[11]方法測定。茶多糖測定參考Dubois等[12]的方法。

1.3.2 茶葉粉益生特性分析

參考馬慧等[10]的配方配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基，小鼠糞便的收集采用的方法是逼迫法，全程需避免雜菌感染，將收集的小鼠糞便放入4組無菌離心管，加入配制好的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），按體積比1∶9稀釋。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 mL糞便稀釋液（接種量為1%），然后向其中加入樣品，待樣品與小鼠糞便稀釋液充分混勻后，37℃下厭氧培養(yǎng)24 h。對照組則以等量的生理鹽水代替茶葉粉樣品，進行相同的接種和厭氧發(fā)酵處理。采用平板計數(shù)法，10倍梯度稀釋。選取合適梯度的稀釋液，移取100 μL稀釋后的樣品，分別均勻涂布于各自的選擇培養(yǎng)基上。

短鏈脂肪酸的測定采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜技術(shù)。將2 mL發(fā)酵液與50 μL的0.5 mol/L H2SO4混合后，一同置于離心管中，加入2 mL乙醚，經(jīng)過30 s的萃取過程，以10 000×g的離心力離心5 min。取上清液用0.45 μm的膜過濾。取1 mL濾得的上清液加入到含有0.25 g無水硫酸鈉的離心管中，再進行取樣測量。

色譜試驗條件如下：色譜柱采用的是規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm的Rtx-Wax毛細管色譜柱，載氣使用的是純度＞99.999%的He，以1 mL/min的恒定流速通過色譜柱。設(shè)定的分流比為10∶1，樣品的進樣量為1 μL，進樣溫度設(shè)定為240℃程序升溫。程序升溫設(shè)置為初溫100℃以10℃/min的速率升溫至140℃，持續(xù)1 min然后以60℃/min的速率程序升溫至200℃，持續(xù)3 min，離子化溫度為230℃，待溫度上升到設(shè)定溫度后，即可開始進樣，待電腦端輸出結(jié)果后，采用外標法，以乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的純組分作標準曲線，得出4組樣品（對照、嫩茶、中等嫩茶和老茶）中分別含有的乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用spss17.0，作圖采用Origin7.0軟件，試驗重復(fù)3個平行取平均值，以p＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉粉益生成分含量分析

2.1.1 茶多酚及兒茶素單體含量分析

茶多酚及兒茶素單體含量見表1。

表1 茶多酚及兒茶素單體測定結(jié)果Table 1 Contents of tea polyphenols and catechins monomers

由表1可見，嫩茶的茶多酚含量達到了（20.27±1.02）%，顯著高于中等嫩茶和老茶。在不同的兒茶素單體中，沒食子酸酯含量最高，達到了（13.53±0.78）%，表兒茶素和兒茶素沒食子酸酯的含量相近。3種時期的茶葉粉中，茶多酚含量與王海利等[13]測得的茶多酚含量相近，處于中等水平。茶多酚及兒茶素單體的含量高低均為：嫩茶＞中等嫩茶＞老茶，且茶多酚及各個兒茶素單體含量在3種時期的茶葉粉中具有顯著差異，這對之后做體外發(fā)酵試驗有很好的比對性。從數(shù)據(jù)走勢上可以得出結(jié)果：茶多酚及主要的兒茶素含量隨著茶葉嫩度的降低而減少。

Mamati等[14]的研究表明，茶多酚在合成中需要多種酶（苯丙氨酸酶、查耳酮合酶、二氫黃酮醇4-還原酶）的參與，在茶的嫩葉中PAL基因和CHS基因能夠得到高度表達，但是在茶的老葉中則幾乎無法檢測到這兩個基因。王偉偉等[15]通過對不同嫩度的紅茶中的各種成分含量進行測定，發(fā)現(xiàn)嫩度越高，紅茶中茶多酚及主要兒茶素的含量越高。張凌云等[16]研究了不同采摘嫩度的綠茶鮮葉中的主要活性成分，發(fā)現(xiàn)隨著茶葉的嫩度增加，綠茶的茶多酚含量逐漸增加，呈正相關(guān)。這與本文得到的結(jié)果一致。

2.1.2 茶游離氨基酸及茶氨酸含量分析

茶游離氨基酸及茶氨酸含量分析見表2。

表2 茶游離氨基酸及茶氨酸測定結(jié)果Table 2 Contents of free amino acids in tea and theanine

本文測定的3種時期的茶葉粉中，嫩茶的游離氨基酸含量最高，為（3.49±0.22）%，顯著高于中等嫩茶和老茶，老茶和中等嫩茶游離氨基酸的含量沒有顯著差異。老茶的茶氨酸含量最低，僅為（1.09±0.07）%。茶氨酸的含量高低為：嫩茶＞中等嫩茶＞老茶。游離氨基酸和茶氨酸的含量在3種時期的茶葉粉中具有顯著差異，具有良好的可比較性。游離氨基酸含量換算后，與文獻中數(shù)值相比[17]，處于較高水平。付贏萱[18]認為，茶葉越老氨基酸含量越低。

王茹蕓等[19]的研究表明，茶葉的級別越高，游離氨基酸含量越高?？梢悦鞔_的是老茶的茶氨酸含量是最低的，而對于嫩茶和中等嫩茶，單從茶葉的采摘時期無法判明，推測可能有其它因素干擾，如栽培條件，氣候影響等[20]。

2.1.3 茶葉膳食纖維含量分析

茶葉膳食纖維含量分析見表3。

表3 茶葉粉膳食纖維測定結(jié)果Table 3 Contents of dietary fiber in tea powder

從表3中可以看出，3種時期的茶粉中，總膳食纖維含量分別占到（24.36±0.54）%，（29.01±0.82）%和（37.62±1.27）%，其中主要部分不可溶。膳食纖維的不同組分中，纖維素的含量最高，老茶可達到（13.83±0.28）%。本文所測定的有關(guān)膳食纖維的指標在3種時期的茶葉粉中的含量高低均為：老茶＞中等嫩茶＞嫩茶。茶葉粉膳食纖維的含量隨著茶葉的嫩度降低而增加，這與徐雪萍[21]的研究中，茶葉的老嫩程度顯著影響著茶葉膳食纖維含量，隨著嫩度的降低，茶葉膳食纖維含量逐漸增加一致。在顯著性方面，3種不同采收時期的茶葉粉的總膳食纖維、不溶性膳食纖維、木質(zhì)素和纖維素具有兩兩顯著差異的特點，而可溶性膳食纖維、果膠和半纖維素在嫩茶與中等嫩茶間無顯著差異，與老茶比則有顯著差異。

2.1.4 茶多糖含量分析

茶多糖含量分析見表4。

表4 茶多糖測定結(jié)果Table 4 Contents of tea polysaccharides

在3種不同采收時期的茶葉粉中，茶多糖的含量高低為：老茶＞中等嫩茶＞嫩茶，最低的嫩茶多糖含量為（50.02±2.00）mg/g，和老茶的（167.04±1.93）mg/g差異顯著。從數(shù)據(jù)走勢上可以得出結(jié)果：茶多糖的含量隨著茶葉的嫩度降低而增加。在顯著性方面，茶多糖含量在3種時期的茶葉粉中具有顯著差異，Wang等[1]也認為老茶中的茶多糖含量比嫩茶中高，與本文的測定結(jié)果一致。這可能由于在生長發(fā)育過程中，茶的葉片通過光合作用形成的糖類不斷積累逐漸增加[22]，另外，隨著茶葉的成熟至衰老，代謝活動變緩，能量消耗逐漸減少，糖類的消耗也在減少。而且茶樹的葉片在生長過程中，葉片的表面積增大，進行光合作用的能力也會相應(yīng)地增大，一部分用于生長代謝，另一部分則會積累。

2.2 茶葉粉益生特性

2.2.1 茶葉粉體外發(fā)酵24 h后腸道菌群計數(shù)結(jié)果

各組茶葉粉體外發(fā)酵24 h后腸道菌群數(shù)量變化見表5。

表5 各組茶葉粉體外發(fā)酵24 h后腸道菌群數(shù)量變化Table 5 Quantity changes of intestinal microflora after 24 h fermentation with tea powder in vitro

幾種菌群中，擬桿菌含量最低，僅為106數(shù)量級，其它菌群數(shù)量級較為接近。其中乳酸菌和雙歧桿菌經(jīng)過茶粉的作用后，由107增長為108數(shù)量級。而大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸球菌受到生長抑制作用，都由107降為106數(shù)量級。3種不同時期的茶葉粉對腸道菌群數(shù)量均有促進或抑制的影響，并且影響程度及顯著性不同。對于乳酸菌、雙歧桿菌、擬桿菌等益生菌，茶葉粉有利于其在腸道中的增殖，茶葉嫩度越低，促進增殖作用越好，老茶組最優(yōu)。乳酸菌及其代謝產(chǎn)物在腸道中起著重要作用：可以降低膽固醇，抑制腸道有害菌的增殖，提高機體免疫力，促進機體對礦物質(zhì)的吸收和能量的轉(zhuǎn)化，維持腸道菌群的微生態(tài)平衡[23-24]，老茶可顯著促進乳酸菌的增殖。

腸道中的雙歧桿菌是主要的革蘭氏陽性嚴格厭氧型益生菌，能夠合成多種消化酶、乳糖酶、多種氨基酸及維生素，具有抗腫瘤、抗衰老，增強機體免疫力等功能，此外還有抑制致病菌的增殖及毒素的侵襲，防止便秘等生理保健作用[25]。3組茶葉粉均可顯著提高雙歧桿菌數(shù)量。隨著茶葉嫩度降低，雙歧桿菌的數(shù)量增加，其中老茶組的雙歧桿菌增殖效果最好。其中，老茶組的膳食纖維和茶多糖含量均是最高的，而膳食纖維和茶多糖是豐富的碳源來源，故可能由于老茶中膳食纖維和多糖含量高可作為碳源被腸道菌群利用。

擬桿菌是對人體有益的共生菌，在促進機體吸收、增強免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)腸道平衡等方面具有重要作用。對擬桿菌的測定結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，同對照組比較，經(jīng)過24 h體外發(fā)酵后，擬桿菌的數(shù)量降低不顯著，即茶葉粉對擬桿菌的增殖并沒有顯著影響。

對于大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜菌、腸球菌等可能引起人體患病的細菌，茶葉粉可以抑制它們的生長繁殖。大腸桿菌是常見的條件致病菌，普遍存在于動物或人體的腸道，在大多數(shù)情況下，大腸桿菌是無害的，但一旦存在引起其致病的因素或者因為特殊原因離開腸道進入泌尿道和腹腔時，會具有感染性。在經(jīng)過24 h體外發(fā)酵后，3組茶葉粉均可抑制大腸桿菌的增殖，其中嫩茶組抑效果最好，可以顯著降低大腸桿菌的數(shù)量。

腸球菌的毒性不高，但是有一定的致病能力，屬于條件致病菌。對腸球菌的結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過24 h體外發(fā)酵后，3組茶葉粉在降低腸球菌數(shù)量方面都具有較為顯著的效果，嫩茶和中等嫩茶抑制效果較好，但二者無顯著性差異。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是對人體有害的一種細菌，厭氧型，能夠?qū)е率澄镏卸竞湍c炎[26]。對產(chǎn)氣莢膜梭菌的結(jié)果進行分析，經(jīng)過24 h體外發(fā)酵后，3組茶葉粉均可以顯著降低產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，但是3種茶葉粉之間則無顯著性差異。原因可能主要有兩方面，一方面，茶多酚有效的抗菌活性已被學界所普遍公認，尤其是對腸道致病菌具有非常有效的抑制和殺滅作用[27]。另一方面，益生菌如乳酸菌和雙歧桿菌等與腸道中的有害菌之間存在拮抗作用，能夠有效抑制有害菌的增殖[28-29]。

2.2.2 茶葉粉體外發(fā)酵24 h后產(chǎn)生的短鏈脂肪酸結(jié)果

茶葉粉體外發(fā)酵24 h后短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的含量見圖1。

圖1 茶葉粉體外發(fā)酵24 h后產(chǎn)生的SCFAs含量Fig.1 SCFAs levels after 24 h in vitro fermentation with tea powder

腸道微生物產(chǎn)生的SCFAs是維持腸道平衡的重要代謝產(chǎn)物，參與體內(nèi)不同器官的多種代謝。乙酸的來源非常廣泛，大多數(shù)細菌代謝均可產(chǎn)生，它在人體中被運輸?shù)礁鱾€組織和器官，參與各項生命活動。在經(jīng)過24 h體外發(fā)酵后，老茶組的乙酸、乳酸含量均為最高。丙酸在大腸中經(jīng)過血液吸收后輸送到肝臟，可以影響肝臟和膽固醇的代謝，抑制膽固醇的合成。腸道中很多微生物都能參與丁酸的合成，丁酸是腸上皮細胞能量的主要來源，可以為其提供60%的能量。經(jīng)過24 h體外發(fā)酵后，3種茶葉粉均能顯著提高丙酸和丁酸的含量，但是3種茶葉粉之間沒有顯著性差異。

綜合來看，3組試驗組中老茶組提高SCFAs含量的作用最優(yōu)，改善腸道環(huán)境的效果最好，可能由于老茶對益生菌的促進效果最好，而SCFAs是益生菌的主要代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)論

通過對嫩茶、中等嫩茶和老茶3種不同時期的綠茶葉粉的主要活性成分進行含量分析，發(fā)現(xiàn)隨著茶葉粉嫩度的降低，茶多酚及主要的兒茶素含量逐漸減少，茶氨酸含量逐漸降低，茶葉粉膳食纖維的含量逐漸增加，茶多糖的含量逐漸增加。中等嫩茶和老茶的游離氨基酸含量相近。而體外發(fā)酵試驗則證明，不同時期的茶葉粉均能調(diào)節(jié)腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)以及豐度，有利于乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌在腸道中的增殖，其中老茶組的促進效果均為最優(yōu)；同時可以抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜菌、腸球菌等可能引起人體患病的細菌在腸道中的生長繁殖，其中嫩茶組對大腸桿菌的抑制效果最佳。3種不同時期的茶葉粉對提高腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs均有促進作用，茶葉粉在促進益生菌在腸道中增殖和提高乳酸、乙酸等短鏈脂肪酸的產(chǎn)量方面，老茶效果均為最優(yōu)。