仝曉輝 汪銀龍 劉曉寧 蘇雨崝

摘要：

為探明再生水補水對河道底泥細菌群落結構的影響，以深圳市西鄉(xiāng)河再生水補水為研究對象，在分析河道8處底泥樣品理化指標的基礎上，運用 Illumina 高通量測序技術探究河道再生水補水后底泥細菌群落結構的空間差異特征以及對環(huán)境因子所產(chǎn)生的影響，并借助冗余分析方法分析河道底泥細菌群落結構空間差異特征的形成原因。分析結果表明：西鄉(xiāng)河中下游底泥含有多種污染物，且中游重金屬污染較為嚴重;河道底泥中的細菌群落結構與多樣性在空間上存在顯著的差異，補水口附近底泥的微生物具有較高的多樣性;河道底泥中優(yōu)勢菌主要有硫桿菌（Thiobacillus）、擬桿菌（Bacteroides）、脫硫菌屬（Desulfatiglans、Desulfococcus、Desulfuromonas）、脫磷菌屬（Desulfomicrobicum）以及反硝化菌屬（Dechloromonas、Ferritrophicum），占克隆文庫的70%以上;再生水中的氮、磷、有機物和Cu和Fe重金屬等物質對補水口附近的底泥反硝化菌屬和脫硫菌屬的多樣性及其豐度具有顯著的影響，而對距離較遠的珠江口底泥微生物影響較小。

關 鍵 詞：

再生水補水; 細菌群落結構; 底泥; 重金屬; 西鄉(xiāng)河

中圖法分類號： X828

文獻標志碼： A

DOI：10.16232/j.cnki.1001-4179.2021.07.010

0 引 言

隨著城市的發(fā)展，城市中多數(shù)河道變成區(qū)域納污河流，一些河道甚至出現(xiàn)了“無水斷流，有水皆黑”的現(xiàn)象，再生水補水是解決這一現(xiàn)象的關鍵[1]。再生水作為城市的穩(wěn)定再生水源，在緩解深圳市地表水資源短缺，城市雨源性河道生態(tài)基流間歇性缺水等問題發(fā)揮了重要作用。然而，再生水補水會影響河道中營養(yǎng)物和污染物的原有狀態(tài)，其可以改變河道水體環(huán)境及污染物遷移路徑，進而影響河道水質及底泥的理化性質[2-4]。另外，河道水質及底泥的理化指標特別是營養(yǎng)物和污染物的變化將對底泥微生物群落結構有顯著影響[5-8]。

目前，大量的學者對河道補水與底泥微生物群落結構的響應關系進行了相關研究。Wakelin等[9]通過利用基因克隆文庫構建與qPCR相結合的方法對污水處理廠排水與河道底泥固氮微生物豐度的響應關系進行了分析，結果表明河道底泥中固氮基因相對豐度與補水水量成正相關;Baniulyte[10]研究分析了以氮、磷等營養(yǎng)鹽為主的補水對水域環(huán)境的影響，研究表明，在高濃度營養(yǎng)鹽污水對河道補水的作用下，底泥中Bacteriodetes類群的相對豐度與有機物降解呈現(xiàn)正相關關系;馬棟山等[11]應用限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）技術分析了京市永定河麻峪濕地再生水補水口附近底泥微生物群落結構的空間差異特征以及其與環(huán)境因子所產(chǎn)生的響應關系，結果顯示，TP和TOC對補水口底泥細菌的多樣性及群落結構有較大的影響，而氨氮的凈化與再生水補水距離有一定關系。由此可見，補水水質情況會對底泥中的微生物造成影響，進而會影響河道水質凈化和污染物修復，因此研究再生水補水與城市納污河道底泥微生物的響應關系，解析影響微生物群落結構變化的主次要環(huán)境因素，探明能夠降解污染物的優(yōu)勢菌屬，將為深圳市河道補水的生態(tài)修復工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域位于深圳市寶安區(qū)西南部，屬于珠江口流域。流域屬亞熱帶海洋性氣候，全年氣溫較高，溫暖無冬。流域內多年平均降雨量為1 667.0 mm，降雨多集中在4～9月，多年平均氣溫約為22.0 ℃，年內氣溫變化較小。西鄉(xiāng)河全長約為7.62 km，流域面積17.78 km2。流域內有固戍污水處理廠為西鄉(xiāng)河進行再生水補水（補水點距離鐵崗水庫約800 m，見圖1），污水廠設計規(guī)模為24萬m3/d，現(xiàn)狀旱季再生水約15萬～18萬m3/d，通過泵站提升西鄉(xiāng)河上游的總量為10萬～11萬m3/d。河道上游因有補水作用，水流動力足，水質較好;河道下游出口為珠江口伶仃洋海區(qū)，因潮汐原因，下游約2.00 km為感潮河段，河道水質受潮汐影響較大，大面積水體呈褐色，且水面經(jīng)常產(chǎn)生刺激性氣味，上下游河道水質及水動力顯現(xiàn)出明顯的差異。

1.2 樣品采集及測定

本研究沿鐵崗水庫至河道入珠江口8個點進行河道底泥采集。根據(jù)鐵排河生態(tài)功能區(qū)劃分，取樣點分布在補水口的上下游，主要包括補水口上游500 m點XN1（尖崗山大道），補水口點XN2（敬老院橋下）及下游1 km等間隔的點XN3（廣深公路）、點XN4（寶安大道）、點XN5（新湖路橋）和點XN6（寶源路橋），距珠江口1 km的點XN7（金科路）及XN8（入珠江口），如圖1所示。每個采樣點利用GPS定位，并利用挖斗式采泥器在距離上覆水10 cm深度處采樣，單個采樣點需采集約600 g底泥，置于干凈密封無菌塑料袋中，隨后帶回實驗室內冷藏處理。在實驗室將樣品分為兩份，并在24 h內對第一份底泥做TN、TP、TOC、NO3--N及重金屬等（再生水中的重要水質因子）常規(guī)理化指標的檢測與分析;另一份底泥進行細菌群落結構的多樣性測定。

1.3 DNA提取與高通量測序

首先提取微生物的DNA，并用NanoDrop2000分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳（Resp）檢測DNA的濃度和完整性，隨后可以進行后續(xù)實驗。然后以提取的DNA為模板，進行第一階段的PCR產(chǎn)物純化，隨即進行第二階段PCR擴增，并對磁珠純化后的PCR產(chǎn)物進行Qubit定量。最后在Illumina MiSeq測序平臺上測序。

1.4 統(tǒng)計分析

使用SPSS 21.0 軟件（SPSS，USA）對8個底泥的理化參數(shù)進行了差異化分析。以細菌群落組成及底泥理化性質數(shù)據(jù)為基礎，利用CANOCO（Version 5.0）進行冗余分析，探明西鄉(xiāng)河細菌群落與環(huán)境因子的相互聯(lián)系。采用R軟件（Version 2.1.1）制作熱圖（heat map），分析不同采樣點底泥優(yōu)勢菌屬在屬水平上群落組成差異性。

2 結果與討論

2.1 底泥沉積物理化性質分析

西鄉(xiāng)河8個樣點底泥的理化指標如表1所列。根據(jù)各個點理化參數(shù)的單因素分析可知：TN、TP、TOC、NH4+-N、NO3--N、Cu、Zn濃度在不同采樣點存在明顯的差異，補水處底泥的TN、TP、TOC、NH4+-N和NO3--N濃度較補水上游都有大幅提升，河道中下游底泥污染物較為嚴重，中游底泥重金屬較上、下游污染嚴重，下游水面大面積呈褐色，且常伴惡臭的氣味產(chǎn)生。補水點下游采樣點隨著補水的距離增加，底泥中理化指標的含量逐漸減少，這是由于底泥中的微生物對TN、TOC、NH4+-N和NO3--N進行了轉化消耗。但在入珠江口處的底泥含量有明顯的突變，這主要是因為下游河道為感潮河段，受到潮汐的頂托效應嚴重，河道翻泥覆新較快，河道中大量的富營養(yǎng)污染物遷移到珠江中，致使水體及底泥中污染物大幅減少。

2.2 細菌群落結構

2.2.1 細菌群落多樣性

通過Miseq高通量測序，對西鄉(xiāng)河8個樣點底泥97%的高質量序列相似度進行OTUs劃分，共取得18 470條OTUs，所有樣點底泥的OTUs數(shù)量最高為2 726條，最低為1 967條。各樣點的微生物多樣性指數(shù)如表2所示，8個底泥樣品中相同的OTUs共有468個，約占OTUs總數(shù)的2.5%，表明西鄉(xiāng)河不同空間的底泥的細菌群落多樣性顯著。所有樣本文庫的覆蓋度為92.72%～97.74%，說明測序能夠深度揭示西鄉(xiāng)河河道底泥中微生物群落的真實情況。由Chao1多樣性指數(shù)顯示，上游XN1、補水點XN2樣點及河道下游感潮河段的Chao1指數(shù)較低，說明下游底泥中微生物豐度較低;XN4、XN5、XN6樣點的Chao1指數(shù)較高，表明底泥中微生物豐度較好。另外，底泥樣品的Simpson指數(shù)在0.80～0.90之間，其中XN4、XN5和XN6樣點Simpson指數(shù)值較高，說明這3處河道底泥具有相對較豐富的群落結構。由Shannon細菌群落多樣性指數(shù)可知：西鄉(xiāng)河河道8個底泥樣品中的Shannon指數(shù)變化范圍較大，XN1樣品Shannon指數(shù)最低，為4.67，說明XN1處的細菌多樣性最低;除此之外，在入珠江口的2個點（XN7和XN8）底泥Shannon指數(shù)也較小，分別為5.33和5.42，且數(shù)值相差較小，說明珠江口處細菌的多樣性存在較小的差異。

用等級-多度（Rank-abundance）曲線[12]比較了8個樣本底泥中微生物的物種豐度和均勻度。由圖2可知：在水平方向上，XN4、XN5 和XN6三個樣點的曲線寬度較寬，其豐度較大;相反，其余樣點的曲線寬度較窄，樣點的微生物豐富度也較小;XN2（補水點）、XN3及XN8三個樣點的Rank-abundance曲線較為光滑，表明這3處河道底泥中的物種均勻度較好;其余5處河道底泥中的物種均勻度較差。

2.2.2 細菌群落組成與結構

對底泥樣品的測試進行生物信息統(tǒng)計分析，結果表明，18 470條OTUs主要屬于8個門，30個屬。由圖3可知：8個底泥樣品的細菌種群結構在門水平上相似，但每種門的豐度確有著很大的差異，在門的水平上，相對豐度從高到低依次是變形菌門（Proteonacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、螺旋藻（Spirochaetes）、放線菌門（Actinobateria）、變形菌門（Epsilonbacteraeota）。其中：主要細菌群為變形菌門Proteonacteria，且在每個樣品中占比均高于50%;其次占比較高的為擬桿菌門，占比均超15%;其余門屬占比較低;這表明了變形菌門和擬桿菌門是西鄉(xiāng)河河道底泥的優(yōu)勢門屬。

為了進一步揭示各樣本底泥微生物的豐度和群落結構，本研究在屬的水平上制作了熱圖（heat map），如圖4所示：西鄉(xiāng)河河道底泥的細菌群落結構相對豐富，但樣品之間的主要菌屬存在明顯差別。XN3、XN4、XN5和XN6 四個樣點底泥擁有豐富的群落結構，而XN7和XN8樣點底泥的群落結構卻相對單一。這主要是因為XN3、XN4、XN5和XN6 四個點位于補水點下游，且與補水點距離較近，補水中的氮、磷及有機物沉積到底泥中，其能夠為細菌提供了較好的營養(yǎng)物質，這4處采樣點為河道的中游，河道中長期有水積存，水流速度較緩，為底泥微生物提供了穩(wěn)定的生存場所。點XN7和XN8距離補水口超過5km，距離較遠，補水對河道底泥微生物的影響較小;另外，XN7和XN8兩個采樣點處于感潮河段，河道水體與珠江水交換頻繁，底泥翻泥換新頻率較高，大量營養(yǎng)物質流向珠江，不利于底泥及水體中微生物的生存，說明潮汐對微生物群落的影響遠遠大于補水的作用。從主要優(yōu)勢屬來看：底泥中微生物的優(yōu)勢菌主要有硫桿菌（Thiobacillus）、擬桿菌（Bacteroides）、脫硫菌屬（Desulfatiglans、Desulfococcus、Desulfuromonas）、脫磷菌屬（Desulfomicrobicum）以及反硝化菌屬（Dechloromonas、Ferritrophicum），這些菌屬在克隆文庫中占比超70%，其均對不同形態(tài)的氮、磷、硫等相關物質的生態(tài)循環(huán)有著直接響應，并對底泥中物質的降解有著顯著作用。從單個樣品來分析：補水點（XN2）的底泥樣品中主要菌屬為反硝化菌屬，可降解補水中的硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮;XN4、XN5和XN6 三個樣品中優(yōu)勢菌屬主要為脫硫菌屬和反硝化菌屬，這對水體及底泥中的硝酸鹽和硫酸鹽的分解還原起著較大作用，產(chǎn)生硫化氫等惡臭氣體;XN7和XN8因受到潮水和漁業(yè)的影響，底泥中氮、磷及硫等物質相比較少，而烴類物質較多，因此優(yōu)勢菌屬主要以烴降解菌（Smithella）為主，此菌屬可以參與珠江口水體及底泥中烴類物質的降解。

2.3 再生水補水對河道底泥微生物環(huán)境響應

在再生水對河道補水的作用下，基于底泥樣品中細菌菌屬類別及底泥理化數(shù)據(jù)基礎，對底泥微生物群落組成與環(huán)境因子進行冗余分析。冗余分析可以解釋微生物群落組成的95.6%，其中PC1軸解釋了多數(shù)微生物菌屬組成，其能夠解釋總變異的70.1%，PC2能夠解釋總變異的25.5%。如圖5所示：XN2、XN3、XN4、XN5和XN6樣點的微生物群落豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)分別與TN、TP、NO3--N、TOC、Cu和Fe 等有較好的相關性，西鄉(xiāng)河補水下游XN4、XN5和XN6 3個點處的緩慢水流和水環(huán)境較長的更新周期，致使再生水中有機物和營養(yǎng)物質沉積河道的底泥中，導致補水下游底泥中碳氮磷濃度顯著高于上游，進而影響底泥中細菌的群落結構和多樣性;河道下游XN7和XN8兩個采樣點底泥中烴類降解菌（Simtjella）和苯類污染物降解菌（Syntrophorhabdus）豐度較高，主要因為珠江口有漁業(yè)存在，水體及底泥中會含有一定量的烴類和苯類物質，為烴類降解菌提供很好的營養(yǎng)物質。

再生水河道補水，不僅為河道加強了水動力，而且為河道帶了大量的氮、磷等物質，多種形態(tài)的氮素循環(huán)可通過水中植物根際微生物固氮、好氧硝化、厭氧反硝化和氨化作用這4個階段進行[13-15]。多種硝化與反硝化微生物對沉積物中無機氮的遷移轉化具有很好的促進作用，大氣中的氮素首先通過固氮、硝化等作用進入生物圈，然后由微生物進行反硝化后再次回到大氣中，進而實現(xiàn)自然界的氮素循環(huán)[16-18]。本研究中補水口（XN2）處有豐度較高的梭菌屬（Dechloromonas），占克隆文庫的32.5%，此菌屬屬于反硝化細菌，在反硝化作用中發(fā)揮重要的作用。另外，在下游XN3、XN4、XN5和XN6 四個采樣點處具有豐度較高的有反硝化菌屬（Dechloromonas、Ferritrophicum）和脫硫菌屬（Desulfatiglans，Desulfococcus，Desulfuromonas），這些菌屬與TN、TP和TOC等物質呈顯著的正相關關系，而Dechloromonas，F(xiàn)erritrophicum與NO-3-N呈負相關關系，反硝化菌屬將對氮素的轉化有良好促進作用。但隨著采樣點逐漸遠離補水口，反硝化菌屬和脫硫菌屬的克隆文庫占比逐漸下降。再生水中含有少量的病原菌、抗生素等，這將對微生物產(chǎn)生較大的危害，再生水補水中大量的有機質為有機厭氧類病原菌的生長供給了優(yōu)越的生境條件。

重金屬是再生水對底微生環(huán)境效應的次要因素。有研究表明不同微生物受到重金屬的影響程度不同，重金屬Cu、Fe、Zn和Pb等污染會影響微生物細胞的代謝功能，使其生物多樣性下降[19]。另外，重金屬也會對微生物群落結構造成影響，本研究通過冗余分析得到河道底泥中不同微生物對重金屬的群落結構的影響。如圖5所示：XN2、XN3和XN4 三處的底泥微生物與重金屬Cu和Fe的具有顯著的相關性，說明Cu和Fe重金屬是這些菌屬群落結構的主要影響因子;點XN7和XN8中的底泥中烴類降解菌（Simtjella）和苯類污染物降解菌（Syntrophorhabdus）與重金屬Zn有一定的相關性，進而解釋了重金屬Zn對珠江口底泥微生物群落結構的具有一定的影響。

3 結 論

（1） 西鄉(xiāng)河河道底泥中的細菌群落結構與多樣性在空間上存在顯著的差異，補水口處底泥的微生物多樣性較高，補水口下游連續(xù)3處采樣點的底泥微生物豐度指數(shù)較高，且有相似的群落結構。

（2） 河道底泥中微生物的優(yōu)勢菌主要有硫桿菌（Thiobacillus）、擬桿菌（Bacteroides）、脫硫菌屬（Desulfatiglans，Desulfococcus，Desulfuromonas）、脫磷菌屬（Desulfomicrobicum）以及反硝化菌屬（Dechloromonas，F(xiàn)erritrophicum），主要菌屬占克隆文庫的70%以上。

（3） 再生水中的氮、磷、有機物和Cu和Fe重金屬等物質對底泥中反硝化菌屬和脫硫菌屬的多樣性及其豐度具有顯著的影響;補水對距離較遠河道底泥微生物的影響較小，珠江口處底泥微生物受到潮汐的影響遠大于補水作用;重金屬Zn對其微生物群落結構的具有一定的影響。

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（編輯：劉 媛）

Influence of reclaimed water replenishment on bacterial community structure in river sediment

TONG Xiaohui1，WANG Yinlong2，LIU Xiaoning2，SU Yuzheng2

（1.China Communications First Highway Survey and Design Institute Co.，Ltd.，Xi′an 710065，China; 2.Xi′an Zhongjiao Environmental Engineering Co.，Ltd.，Xi′an 710065，China）

Abstract：

To clarify the influence of reclaimed water replenishment on the bacterial community structure of river sediments，the reclaimed water replenishment of the Xixiang River in Shenzhen City was taken as the research object，based on the analysis of the physical and chemical indicators of 8 sediment samples in the river channel，the Illumina high-throughput sequencing technology was used to explore the spatial difference in the bacterial community structure of the sediment after the reclaimed water in the river channel and its impact on environmental factors.In addition，the formation reasons for the spatial difference of the bacterial community structure are analyzed by redundancy analysis method.The analysis results show the sediment in the middle and lower reaches of the Xixiang River contains a variety of pollutants，and the heavy metal pollution is more serious in the middle reaches;there are significant spatial differences in the bacterial community structure and diversity in river sediments，and a high diversity of microorganisms in the bottom mud near the water replenishment port;the dominant bacteria in the river sediments are Thiobacillus，Bacteroides，Desulfatiglans，Desulfococcus，Desulfuromonas，Desulfomicrobicum，and denitrifying bacteria（Dechloromonas，F(xiàn)erritrophicum），which accounts for more than 70% of the cloned library;Nitrogen，phosphorus，organics，and heavy metals such as Cu and Fe in the reclaimed water are responsible for the diversity and abundance of denitrifying bacteria and desulfurizing bacteria in the sediments near the water intake，it has a significant effect on the degree，but it has little effect on microorganisms in the sediments of the Pearl River Estuary.

Key words：

reclaimed water replenishment;bacterial community structure;sediment;heavy metal;Xixiang River