張奕梅 宋鵬書 彭 晶 閉炳才 譚媛媛 黃飛燚

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，南寧市 530003，電子郵箱：188950317@qq.com)

羊水是胎兒賴以生存的內(nèi)環(huán)境，其既可保持子宮內(nèi)溫度恒定以利于新陳代謝，又可緩沖外界壓力保護(hù)胎兒，使胎兒在宮內(nèi)有一個(gè)適宜的活動(dòng)空間，在胎兒發(fā)育過程中起著重要作用[1]。妊娠晚期羊水量少于300 mL者稱為羊水過少，發(fā)生率為4%，羊水過少嚴(yán)重影響圍生兒的預(yù)后，使圍生兒相關(guān)疾病患病率、死亡率明顯增加[2]。目前關(guān)于不明原因羊水過少的發(fā)生機(jī)制的研究報(bào)告較少，一般認(rèn)為不明原因羊水過少的發(fā)生主要與胎盤功能有關(guān)[3]，而缺乏針對胎盤組織微觀方面更為深入的研究報(bào)告。本文通過檢測自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅱ、P62在不明原因羊水過少孕婦胎盤組織中的表達(dá)情況，探討孕婦妊娠期不明原因羊水過少與胎盤發(fā)生自噬反應(yīng)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年3～8月于廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院分娩的30例不明原因羊水過少孕婦作為觀察組，30例羊水量正常孕婦作為對照組。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)單胎，妊娠37～41周，孕婦年齡18～35歲；(2)B超檢查提示羊水過少，即羊水指數(shù)≤5 cm或羊水最大暗區(qū)垂直深度≤2 cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)胎兒異常(包括染色體異常)、胎膜早破；(2)孕婦年齡≤18歲或≥35歲；(3)孕婦合并肝腎功能不全、甲狀腺功能異常、糖尿病、高血壓等心血管疾??；(4)存在妊娠高血壓(子癇)、妊娠糖尿病等妊娠期并發(fā)癥。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 單胎，妊娠37～41周，孕婦年齡18～35歲；(2) B超檢查提示羊水指數(shù)>5 cm或羊水最大垂直深度>2 cm。排除標(biāo)準(zhǔn)同觀察組。入選本研究的孕婦對研究知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 多聚甲醛固定液(Sigma公司，批號(hào)：P-6148)，LC3-Ⅱ單抗隆抗體(包含LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ；CST公司，批號(hào)：#4599)，P62多克隆抗體(SAB公司，批號(hào)：#13222)，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,批號(hào)：bs-0061R)，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(博士德生物工程有限公司，批號(hào)：AR0146)；山羊抗兔熒光二抗(Jackson ImmunoResearch公司,批號(hào)：140987)，顯影液(Bio-Rad公司，批號(hào)：#170-5060)。

1.3 樣本采集 于胎盤娩出10 min內(nèi)，避開明顯梗死或鈣化區(qū)域，于胎盤母體面中央快速取適量胎盤組織，用生理鹽水將血液沖洗干凈，用吸水紙吸干，放入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 透射電鏡觀察胎盤組織中的自噬體 用生理鹽水沖凈胎盤組織血液，將胎盤切成大小約1 mm3的組織塊放入EP管，加入3%戊二醛緩沖固定液(北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：BTN160240)固定2 h，PBS緩沖液沖洗，向樣品中加入2%四氧化鋨緩沖固定液(上海碩光電子科技有限公司，批號(hào)：P0011841)進(jìn)行后固定; 用梯度乙醇對樣品進(jìn)行梯度脫水;丙酮置換樣品中乙醇，然后進(jìn)行環(huán)氧樹脂滲透，包埋，聚合，切成0.5 mm×0.3 mm面積大小的薄片，然后使用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行電子染色，在透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社，型號(hào)：JEM-2100)下觀察細(xì)胞中自噬體變化。

1.5 免疫印跡試驗(yàn)檢測胎盤組織中自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ、P62的表達(dá) 取0.1 g胎盤組織，用生理鹽水洗凈組織表面的血跡，稱重后剪碎組織放入EP管中，用電動(dòng)勻漿機(jī)研碎，加入組織裂解液，放在冰盒上裂解40 min，然后在4℃、3 500 r/min、離心20 min，提取組織總蛋白，使用二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品蛋白，120 mA恒定電流將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，脫脂奶粉室溫下封閉30 min，TBST沖洗3次，5 min/次。加入一抗(LC3和P62的稀釋比例為1 ∶500，β-actin為1 ∶1 000),4℃搖晃孵育過夜,TBST沖洗3次，5 min/次，加入二抗(1 ∶8 000)室溫孵育1 h，TBST沖洗3次，5 min/次，顯影液顯色。結(jié)果用凝膠成像分析軟件處理，計(jì)算各組目的蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次采取均值。

1.6 免疫組化檢測胎盤組織中自噬蛋白LC3-Ⅱ、P62的表達(dá) 取大小約1 cm3的胎盤組織塊，用生理鹽水漂洗血液，置于4%的多聚甲醛緩沖固定液中固定24 h。然后組織塊脫水，石蠟包埋，切成4 μm厚度薄片，放入37℃溫水表面讓切片充分伸展后貼到載玻片上，再依次浸入二甲苯、乙醇脫掉切片表面的蠟層。高壓修復(fù)，3%雙氧水中孵育。用PAP筆在組織切邊畫圈，然后滴加封閉液。一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min。蘇木素染色1 min，分化反藍(lán)，梯度乙醇脫水，樹膠封片，在顯微鏡下觀察陽性面積(黃棕色區(qū)域)大小。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次并如實(shí)記錄。

1.7 蘇木精-伊紅染色觀察兩組胎盤組織的病理學(xué)差異 取大小約1 cm3胎盤組織塊，用生理鹽水漂洗血液，置于4%的多聚甲醛緩沖固定液中固定24 h。然后組織塊脫水，行石蠟包埋，切成4 μm厚度薄片，放入37℃溫水表面讓切片充分伸展后貼到載玻片上，再依次浸入二甲苯，乙醇脫掉切片表面的蠟層。蒸餾水沖洗，然后將載玻片放入蘇木精溶液中染色，流水沖洗，放入37℃溫水中反藍(lán)，晾干，中性樹膠封固保存，在顯微鏡下觀察染色情況，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次并如實(shí)記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組胎盤組織中的自噬體 通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組正常胎盤組織內(nèi)部細(xì)胞器結(jié)構(gòu)相比，觀察組胎盤組織中存在大量雙層膜的自噬體和單層膜結(jié)構(gòu)自噬溶酶體，其中包裹變性壞死的細(xì)胞器和部分蛋白質(zhì)，見圖 1。

對照組 觀察組

2.2 兩組胎盤組織中自噬蛋白LC3-Ⅱ和P62的表達(dá) 免疫印跡試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，觀察組胎盤組織中LC3-Ⅱ 的相對表達(dá)水平升高，P62蛋白的相對表達(dá)水平降低(均P<0.05)，見表1和圖2。 免疫組化檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，觀察組的LC3-Ⅱ蛋白陽性表達(dá)區(qū)域明顯增多，但是P62蛋白陽性表達(dá)區(qū)域減小，與免疫印跡試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，見圖3。

表1 兩組胎盤組織中自噬蛋白LC3-Ⅱ和P62相對表達(dá)水平的比較(x±s)

圖2 兩組胎盤組織中LC3-Ⅱ和P62蛋白的表達(dá)情況

圖3 兩組胎盤組織中 LC3-Ⅱ和P62蛋白的表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

2.4 兩組胎盤組織的病理學(xué)結(jié)果 蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示對照組的胎盤組織內(nèi)部細(xì)胞排列整齊，絨毛組織幾乎無破損，而觀察組的胎盤組織內(nèi)部出現(xiàn)細(xì)胞溶解，胎盤組織中的血管有水腫破裂，見圖4。

圖4 兩組胎盤組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果(蘇木精-伊紅染色，×200)

3 討 論

羊水對維持胎兒正常的生長發(fā)育具有重要的作用，羊水過少是產(chǎn)科常見的妊娠期并發(fā)癥，其發(fā)生率為4%[4]。羊水過少的胎兒可因臍帶受到擠壓，發(fā)生宮內(nèi)缺氧、缺血及窒息。有研究結(jié)果顯示，當(dāng)羊水量少于50 mL，圍產(chǎn)兒病死率高達(dá)88%[5-6]。羊水過少的原因有胎兒結(jié)構(gòu)異常、羊膜病變、母體因素等，但部分羊水過少的病例臨床原因不明，因此值得進(jìn)一步深入研究。

自噬是一種保守的細(xì)胞自我降解方式，當(dāng)組織或細(xì)胞發(fā)生炎癥和受到不良刺激時(shí)就會(huì)發(fā)生自噬反應(yīng)，通過自噬溶酶體吞噬自身受損的胞質(zhì)或細(xì)胞器達(dá)到細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)和能量再利用的目的[7-8]。孫曉東等[9]發(fā)現(xiàn)通過白藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，可抑制宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，提示干預(yù)細(xì)胞自噬性死亡為癌癥的治療提供很好的思路，但是在妊娠期，細(xì)胞自噬反應(yīng)過度會(huì)產(chǎn)生一系列不良影響。近年來有研究表明，自噬可在受精卵著床、胎盤形成和分娩多個(gè)過程中影響妊娠[10]，其在妊娠過程中發(fā)揮重要的作用，但細(xì)胞自噬反應(yīng)過度也會(huì)導(dǎo)致不良妊娠并發(fā)癥的發(fā)生，如子癇前期、妊娠期糖尿病、胎兒生長受限等。夏炳章等[11]發(fā)現(xiàn)子癇前期的發(fā)生是由于缺氧環(huán)境下，細(xì)胞氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)，可能通過過度自噬反應(yīng)而損傷胎盤絨毛結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胎盤發(fā)育不全。然而，自噬是否與不明原因羊水過少發(fā)生有關(guān)，目前仍無相關(guān)研究報(bào)告。投射電鏡是檢測細(xì)胞自噬的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究中，在投射電鏡下發(fā)現(xiàn)不明原因羊水過少孕婦的胎盤組織中自噬體與自噬溶酶體的數(shù)量多于正常胎盤組織，因此推斷羊水過少可能與自噬體數(shù)量增加有關(guān)。但細(xì)胞自噬是一個(gè)循環(huán)動(dòng)態(tài)過程，因此自噬體數(shù)量并不能說明自噬水平的高低[12]。而LC3-Ⅱ、P62是自噬關(guān)鍵性的蛋白，在自噬體形成中發(fā)揮重要的作用，可直接反映自噬水平，其中LC3-Ⅱ的表達(dá)含量與自噬反應(yīng)呈正相關(guān)，而P62的表達(dá)含量與自噬反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)[13-14]。因此，我們進(jìn)一步檢測了胎盤組織中LC3-Ⅱ、P62的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，羊水過少者的胎盤組織中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平高于正常胎盤組織，P62蛋白表達(dá)水平低于正常胎盤組織，這說明羊水過少的胎盤組織中存在自噬反應(yīng)過度現(xiàn)象。

自噬是一把雙刃劍，在缺氧微環(huán)境下，細(xì)胞自噬的主要作用是避免損傷的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能；當(dāng)細(xì)胞自噬水平過高時(shí)，會(huì)損傷細(xì)胞內(nèi)正常的細(xì)胞器組織，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡[15]。為了驗(yàn)證羊水過少與細(xì)胞自噬反應(yīng)之間的關(guān)系，我們對兩組胎盤組織進(jìn)行HE染色后觀察病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)正常孕婦的胎盤組織內(nèi)部細(xì)胞排列整齊清晰，而羊水過少孕婦的胎盤組織中出現(xiàn)細(xì)胞溶解和血管水腫破裂。由此推斷，自噬反應(yīng)過度導(dǎo)致細(xì)胞中細(xì)胞器損壞嚴(yán)重，致使細(xì)胞死亡，最終發(fā)生胎盤病變間接導(dǎo)致羊水減少。

綜上所述，不明原因羊水過少的發(fā)生機(jī)制之一可能是胎盤組織中細(xì)胞自噬反應(yīng)過度致使細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，血管組織發(fā)生破損，最后導(dǎo)致胎盤組織發(fā)生病變致使羊水減少。但本研究沒有進(jìn)一步分析相關(guān)信號(hào)通路導(dǎo)致胎盤組織發(fā)生過度自噬反應(yīng)的機(jī)制，這將是今后的研究方向。