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        銅綠假單胞菌基因分子分型技術(shù)的研究進(jìn)展▲

        2021-11-30 22:32:18藍(lán)如束何本進(jìn)黃盼柳
        廣西醫(yī)學(xué) 2021年12期
        關(guān)鍵詞:銅綠單胞菌分型

        藍(lán)如束 羅 丹 何本進(jìn) 黃盼柳

        (1 廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院檢驗(yàn)科,南寧市 530021,電子郵箱:gxlrshu@163.com;2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院生物統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室,南寧市 530200)

        【提要】 銅綠假單胞菌是醫(yī)院常見(jiàn)的條件致病菌,同時(shí)也是造成院內(nèi)感染的重要病原菌,可引起多種疾病,嚴(yán)重感染時(shí)可危及患者生命?;蚍肿臃中图夹g(shù)是追蹤感染源及分子流行病學(xué)分析的重要手段,對(duì)于控制醫(yī)院內(nèi)感染、確定流行菌株具有重要意義。本文就銅綠假單胞菌基因分子分型技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

        銅綠假單胞菌是一種非發(fā)酵的革蘭氏陰性桿菌,也是常見(jiàn)的條件致病菌,其致病性較強(qiáng),可引起多種疾病,如囊性纖維化、肺炎、尿路感染、外耳炎、傷口感染、骨和關(guān)節(jié)感染、菌血癥和全身性感染等,嚴(yán)重感染時(shí)可危及患者生命[1-3]。國(guó)際醫(yī)院感染控制聯(lián)盟對(duì)全世界703個(gè)重癥監(jiān)護(hù)病房進(jìn)行了監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌是引起院內(nèi)感染的最主要病原菌,其次是鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯氏菌[4]。全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示,在臨床分離的細(xì)菌中,銅綠假單胞菌分離數(shù)量排名第四(8.76%)[5]。由此可見(jiàn),銅綠假單胞菌的感染是不容忽視的問(wèn)題。近年來(lái),耐多藥和廣泛耐藥銅綠假單胞菌的出現(xiàn),給臨床治療帶來(lái)很大的困難,同時(shí)也成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題[6]。隨著分子分型技術(shù)的快速發(fā)展,臨床上分子分型技術(shù)可用于銅綠假單胞菌的分子分型和同源性分析,對(duì)于判斷感染來(lái)源、切斷傳播途徑、控制感染蔓延具有非常重要的意義。本文就目前銅綠假單胞菌分子分型技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

        1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

        隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)是由美國(guó)科學(xué)家Williams等[7]在1990年發(fā)明的一種基因分型方法,是基于PCR技術(shù)的一種分子生物學(xué)方法,可對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行多態(tài)性分析。該方法以DNA單一引物為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增后經(jīng)凝膠電泳獲得非特異性條帶,若條帶相同則可判斷為同源菌株[7]。RAPD具有穩(wěn)定性較好,分辨率高,不需明確基因組序列即可進(jìn)行分型,對(duì)DNA模板要求質(zhì)量不高,操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。但也存在重復(fù)性稍差,不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果以及流行菌株特征難以比較的缺點(diǎn)[8]。該方法廣泛應(yīng)用于追蹤醫(yī)院院內(nèi)感染傳染源和疫情處置。Trautmann等[9]利用RAPD檢測(cè)重癥監(jiān)護(hù)病房患者病灶和自來(lái)水中銅綠假單胞菌的基因,發(fā)現(xiàn)有50%的銅綠假單胞菌有相同基因,認(rèn)為病房的自來(lái)水可能是引起患者銅綠假單胞菌感染的主要原因。有學(xué)者[8]通過(guò)RAPD發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌常見(jiàn)基因型對(duì)抗生素的耐藥程度和毒力較強(qiáng),耐藥菌株易發(fā)生醫(yī)院院內(nèi)感染[10]。

        2 多位點(diǎn)序列分型

        多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)是于1998年提出的一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法,該方法是在多位點(diǎn)酶電泳法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)。MLST通過(guò)PCR擴(kuò)增菌株的多個(gè)管家基因(每株菌株通常有七個(gè)或多個(gè)管家基因),并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì),鑒定菌株的等位基因型與序列類型,通過(guò)比較序列類型來(lái)判斷菌株是否具有同源性,以此對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型[11-12]。銅綠假單胞菌有acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE等7個(gè)管家基因[13],其基因引物序列可在PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。MLST具有較強(qiáng)的種內(nèi)分辨率,結(jié)果重復(fù)性好,在不同的實(shí)驗(yàn)室間有良好的可比性[14]。Gomila等[15]應(yīng)用MLST對(duì)銅綠假單胞菌的遺傳多樣性進(jìn)行分析,認(rèn)為該方法可作為院內(nèi)感染或疫情暴發(fā)的調(diào)查手段。Blanc等[16]應(yīng)用全基因組測(cè)序與MLST兩種方法對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究,結(jié)果顯示兩種方法的同源性分辨率相同。MLST的缺點(diǎn)是操作過(guò)程所需的儀器特殊、成本高、費(fèi)時(shí)等,從而限制了其在醫(yī)院的推廣普及[17]。

        3 腸桿菌基因間重復(fù)共有序列PCR

        腸桿菌基因間重復(fù)共有序列PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR,ERIC-PCR)是一種基于PCR的擴(kuò)增技術(shù),其通過(guò)對(duì)細(xì)菌高度保守重復(fù)序列進(jìn)行擴(kuò)增,依據(jù)擴(kuò)增條帶的位置和數(shù)量來(lái)判斷是否為同一基因型[18]。銅綠假單胞菌擴(kuò)增引物序列為:上游引物5′-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-3′,下游引物5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[19]。ERIC-PCR法的優(yōu)點(diǎn)是成本低,操作簡(jiǎn)單,具有良好的分辨率[20];同時(shí)也存在以下局限性:基因組重復(fù)序列有可能出現(xiàn)突變、缺失等情況,造成擴(kuò)增無(wú)條帶現(xiàn)象;其次PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度不能確定,可導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)顯像模糊、缺失的現(xiàn)象[21],影響結(jié)果的判斷。臨床上常用ERIC-PCR來(lái)判斷菌株的同源性。Zarei等[22]應(yīng)用該方法調(diào)查醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房環(huán)境、住院患者和病房蟑螂的銅綠假單胞菌,共分離到109株銅綠假單胞菌,經(jīng)ERIC-PCR法分析,結(jié)果顯示,不同來(lái)源銅綠假單胞菌的分離株之間存在14個(gè)不同的基因組重復(fù)序列指紋圖譜,表明住院患者、重癥監(jiān)護(hù)病房環(huán)境和病房蟑螂的分離株具有同源性關(guān)系。盧雯君等[23]對(duì)重癥監(jiān)護(hù)室分離到的112株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)可將112株菌株分為5個(gè)基因型,菌株間呈高度同源性,認(rèn)為病房?jī)?nèi)存在互相傳播的可能。

        4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

        脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)是利用周期性交替變換電場(chǎng)方向分離大片段DNA的一種方法,在脈沖場(chǎng)凝膠電泳作用下,可有效分離10 kb至10 Mb大小片段的DNA分子,相近和相似的物種DNA分子將出現(xiàn)相似的圖譜,以此判斷其同源性[24]。標(biāo)本電泳前需利用限制性內(nèi)切酶將物種DNA分子消化分解成大小不一的片段;選擇限制性內(nèi)切酶時(shí),對(duì)于已測(cè)序的基因組DNA,要求其具有相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn),但如果基因組DNA尚未測(cè)序,則可以根據(jù)生物體的G+C含量來(lái)選擇限制性內(nèi)切酶;銅綠假單胞菌常用的限制性內(nèi)切酶為SpeⅠ或XbaⅠ[25]。因PFGE的分辨率高,可以對(duì)菌株大部分基因組(>90%)進(jìn)行同源性分析,且不需要合成引物,其已成為醫(yī)院感染暴發(fā)調(diào)查中分子流行病學(xué)研究的重要手段,也被譽(yù)為細(xì)菌分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[26]。但PFGE操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)(約2~3 d),且需要配備專業(yè)設(shè)備和操作熟練的檢測(cè)人員;此外,其還存在電泳結(jié)果的影響因素較多(如電泳的電壓和時(shí)間、電泳液的濃度和溫度等)和重復(fù)性較差等缺點(diǎn)[27-28]。該方法常用于病原菌的同源性分析,對(duì)疫情處置和控制醫(yī)院院內(nèi)感染起到重要作用,同時(shí)還可用于監(jiān)測(cè)土壤或水中的微生物。

        5 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析

        多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)是一種基于PCR檢測(cè)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列的基因分型方法[29-30],原理是通過(guò)PCR擴(kuò)增串聯(lián)重復(fù)區(qū)并測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物的大小,再通過(guò)凝膠電泳或高分辨率毛細(xì)管電泳確定每個(gè)位點(diǎn)的重復(fù)數(shù),根據(jù)重復(fù)數(shù)區(qū)分等位基因,利用MLVABank公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://mlva.i2bc.paris-saclay.fr/mlvav4/genotyping/)進(jìn)行微生物基因分型,可以利用來(lái)自多個(gè)重復(fù)區(qū)域的一組等位基因?qū)寺∪哼M(jìn)行鑒定[29]。由于其操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)通量大、不需要配備特殊儀器、成本低、結(jié)果重復(fù)性好、分辨率高、在不同的實(shí)驗(yàn)室之間可相互比較等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌的分子分型和溯源性追蹤[31]。隨著該技術(shù)越來(lái)越完善,MLVA已成為醫(yī)院流行病學(xué)調(diào)查中主流的克隆性基因分型方法[32]。但缺點(diǎn)是一株菌株需要對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增,存在檢測(cè)工作量大等不足。

        6 基于PCR的開放閱讀框分型

        基于PCR的開放閱讀框分型(PCR-based open-reading frame typing,POT)是一種基于多重PCR技術(shù)檢測(cè)多個(gè)開放閱讀框(open-reading frame,ORF)分布情況的方法,其通過(guò)凝膠電泳來(lái)判斷每個(gè)ORF是否缺失,結(jié)果以數(shù)據(jù)1和0的格式顯示,通過(guò)十進(jìn)制換算成POT數(shù)值[33]。銅綠假單胞菌是通過(guò)檢測(cè)10個(gè)小基因島ORF和7個(gè)基因島ORF計(jì)算得到每株菌株的POT數(shù)值,POT數(shù)值相同的菌株可判斷為具有同源性[34]。該方法具有操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低、重復(fù)性好、檢測(cè)時(shí)間短(約4 h)、實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果易于對(duì)比、設(shè)備需求簡(jiǎn)單(只需要普通PCR儀器和瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備)等優(yōu)點(diǎn),可以作為許多國(guó)家和地區(qū)普通臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)分子流行病學(xué)分析和鑒定細(xì)菌遺傳譜系的方法[33]。但與PFGE和MLST相比,POT的分辨率略低[34]。Suzuki等[34]將POT應(yīng)用于銅綠假單胞菌基因分型,通過(guò)對(duì)不同銅綠假單胞菌(PAO1、PA7、UCBPP-PA14和LESB58)全基因組序列的比較,篩選出17個(gè)ORF作為銅綠假單胞菌的標(biāo)志物。

        7 全基因組測(cè)序單核苷酸多態(tài)性分型

        全基因組測(cè)序技術(shù)是通過(guò)對(duì)病原菌基因組進(jìn)行測(cè)序,以獲得有關(guān)病原菌檢測(cè)、鑒定、分型和藥物敏感性等信息[35]。全基因組測(cè)序的檢測(cè)過(guò)程比較復(fù)雜,需要配備特殊儀器和軟件,對(duì)檢測(cè)人員能力要求較高[36]。近年來(lái),隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,測(cè)試通量增加及成本的降低,該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床和流行病學(xué)調(diào)查中[37]。全基因組測(cè)序的明顯優(yōu)勢(shì)是在單次運(yùn)行中可產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)個(gè)讀數(shù),然后通過(guò)專用處理軟件進(jìn)行組裝,最終構(gòu)建菌株基因組的完整核苷酸序列,其具有靈敏度和特異度較高、能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)病原菌變異和新的病原體等優(yōu)點(diǎn)[38]。但全基因組測(cè)序也存在以下的局限性[36,39]:不能檢測(cè)標(biāo)本中所有微生物,標(biāo)本中含有低濃度微生物和難破壁的微生物時(shí)易出現(xiàn)漏檢;不能分析特定耐藥基因或毒力基因;數(shù)據(jù)處理及其分析需要具有生物信息學(xué)分析能力的技術(shù)人員等。

        8 小 結(jié)

        由于不規(guī)范使用抗菌藥物而導(dǎo)致院內(nèi)感染的情況時(shí)有發(fā)生,但目前細(xì)菌表型分型和分子分型技術(shù)均存在不足,因此未能滿足臨床應(yīng)用。隨著分子分型技術(shù)的快速發(fā)展,臨床上迫切需要一種操作簡(jiǎn)便、分辨率高、重復(fù)性好、費(fèi)用低、不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果有可比性的分型方法。近年來(lái),高通量全基因組二代測(cè)序在臨床上普及應(yīng)用,測(cè)序成本越來(lái)越低,全基因組測(cè)序分型將有望替代目前已有的分型方法。各醫(yī)療單位應(yīng)該結(jié)合自身技術(shù)條件選擇適當(dāng)?shù)姆中头椒ù_定感染源和傳播途徑,及時(shí)采取防控措施,減少感染的發(fā)生。

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