華 珍

（福建省武夷山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 武夷山 354300）

近來(lái)年，國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)對(duì)豬病的防控意識(shí)逐漸提高，但仔豬腹瀉仍然是威脅我國(guó)生豬養(yǎng)殖發(fā)展的主要疾病之一，且每年因仔豬腹瀉死亡所引發(fā)的經(jīng)濟(jì)損失巨大。在生豬飼養(yǎng)過(guò)程中，導(dǎo)致仔豬腹瀉的病毒性病原種類繁多，其中包括有常見的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬輪狀病毒（PRoV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬細(xì)小病毒（PPV）等，但以上病原（尤其是腸道病毒）感染仔豬所導(dǎo)致的臨床癥狀及病理變化較為相似，傳統(tǒng)的臨床診斷無(wú)法對(duì)致病病因進(jìn)行確診，繼而延誤疾病的防治[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以PCR/RT-PCR技術(shù)為核心的檢測(cè)方法廣泛應(yīng)用于豬場(chǎng)病原的快速診斷，這為疾病的防控提供了便捷的技術(shù)手段。

2020年11月初，福建南平地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)仔豬暴發(fā)腹瀉疫情，筆者根據(jù)發(fā)病仔豬臨床癥狀特點(diǎn)，采集其小腸組織樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，最終結(jié)果顯示該場(chǎng)暴發(fā)疫情是由PEDV變異株感染所引起，其具體診斷過(guò)程如下。

1 材料與方法

1.1 病情介紹及病料來(lái)源

福建南平某豬場(chǎng)飼養(yǎng)繁殖母豬40余頭，該場(chǎng)于2020年11月初開始，部分欄舍仔豬開始腹瀉，其后豬場(chǎng)飼養(yǎng)員給腹瀉仔豬灌喂抗生素，但效果不佳。至11月7日，該場(chǎng)已有80余頭仔豬發(fā)病，其中42頭仔豬死亡。

據(jù)養(yǎng)殖戶介紹，發(fā)病豬群典型臨床癥狀即為急性腹瀉，且部分仔豬有嘔吐現(xiàn)象，病豬死亡大部分原因是嚴(yán)重脫水。為對(duì)導(dǎo)致該病的病因進(jìn)行確診，該場(chǎng)采集嚴(yán)重發(fā)病的仔豬小腸、腹股溝淋巴結(jié)送至武夷山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局進(jìn)行病原診斷。

1.2 主要材料

DNA/RNA核酸提取試劑盒購(gòu)自于北京生化科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自于伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；Taq PCR Mix預(yù)混液、DL 2 000 Marker和瓊脂糖粉末等均購(gòu)自于上海生物工程科技公司。

1.3 方法

1.3.1 病料處理與核酸提取 用滅菌刀將小腸和淋巴結(jié)組織切碎后，取0.2 g組織與1.0 mL生理鹽水混合，高速勻漿后離心，取200 μL上清液根據(jù)DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書對(duì)樣本核酸進(jìn)行提取，將核酸中RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA樣品保存于-80 ℃，待檢。

1.3.2 病原檢測(cè) 應(yīng)用商業(yè)化病原檢測(cè)試劑盒采用real-time PCR法分別檢測(cè)樣品中是否含有PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV、PRV、PPV和PCV2，根據(jù)樣品Ct值判定其是否為對(duì)應(yīng)病原陰陽(yáng)性。

1.3.3 PEDV S1基因序列擴(kuò)增及分析 用一對(duì)特異性引物擴(kuò)增PEDV S1基因序列，其中RT-PCR體系（50.0 μL）中包含2×PCR mix預(yù)混液25.0 μL、上下游引物（10 pmol/L）各2.0 μL、模板cDNA 3.0 μL及雙蒸水18.0 μL，反應(yīng)條件為94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，其后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并切膠回收后送至生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

將返回序列進(jìn)行拼接后，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST，比較該序列與GenBank上收錄的不同PEDV毒株對(duì)應(yīng)序列的同源性，確定本次獲得毒株所屬的基因型。

2 結(jié)果

2.1 病原檢測(cè)結(jié)果

使用商業(yè)化試劑盒分別檢測(cè)可能導(dǎo)致仔豬腹瀉的病毒性病原，結(jié)果發(fā)病豬組織樣品中僅檢測(cè)出PEDV核酸。此外，我們對(duì)樣品進(jìn)行處理后接種在普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)任何菌落形成，提示該場(chǎng)仔豬腹瀉是由PEDV感染所引起。

2.2 PEDV S1基因擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果

使用一對(duì)特異性引物應(yīng)用PCR法擴(kuò)增PEDV S1基因序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，本文擴(kuò)增序列大小約為1 900 bp左右，與預(yù)期大小基本一致，且無(wú)非特異性條帶，提示擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為PEDV S1基因序列。

圖1 PEDV S1基因序列擴(kuò)增PCR產(chǎn)物凝膠電泳

2.3 PEDV S1基因序列變異情況分析

將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行純化后送至生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序，對(duì)返回序列進(jìn)行拼接，最終序列大小為1 983 bp。核苷酸序列同源性分析結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，該毒株S1基因序列與GenBank收錄的PEDV中國(guó)流行變異株（KY624222.1和KY624212.1）同源性較高，均超過(guò)97.4%，但與PEDV疫苗株（JN599150.1）同源性相對(duì)較低，僅為92.2%。根據(jù)以上結(jié)果可判定該場(chǎng)暴發(fā)疫情是由于PEDV變異株感染所引起。

圖2 PEDV分離株S1基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果

3 討論與思考

近年來(lái)，很多養(yǎng)殖場(chǎng)極大程度地提高了生物安全防控水平，這對(duì)疫病防控起到了積極的作用。但仔豬腹瀉仍然在豬場(chǎng)較為常見，且導(dǎo)致仔豬腹瀉病原較多，傳統(tǒng)的臨床診斷辦法無(wú)法對(duì)此類病原進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，準(zhǔn)確對(duì)致病原進(jìn)行鑒定需依靠更加方便快捷的分子生物學(xué)方法。

PEDV在我國(guó)是導(dǎo)致仔豬腹瀉的主要病原之一，該病原為RNA病毒，屬于冠狀病毒科，其基因組變異速率較快，給相應(yīng)的防控帶來(lái)巨大的考驗(yàn)。在2010年以后我國(guó)出現(xiàn)了PEDV變異株，與傳統(tǒng)毒株相比，變異株毒力更強(qiáng)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)危害也更大。在PEDV基因組中，S1基因變異速率相對(duì)較快，選擇以S1基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析可初步明確毒株基因型和變異情況[2-3]。

本文涉及到的案例為仔豬嚴(yán)重腹瀉，但傳統(tǒng)的臨床診斷無(wú)法對(duì)病原進(jìn)行確診，筆者采用分子生物學(xué)方法對(duì)病原進(jìn)行確診，最終確定為PEDV感染引起。由于PEDV分為疫苗株和變異株，這兩種毒株均可導(dǎo)致仔豬腹瀉，但基于疫苗株研發(fā)的疫苗對(duì)變異株的防控能力有限，故筆者通過(guò)擴(kuò)增與分析該毒株的S1基因變異情況，確定該毒株屬于變異株。對(duì)于豬流行性腹瀉的防控，養(yǎng)殖場(chǎng)可以采用生物防控＋疫苗接種模式進(jìn)行，其中生物防控包括定期消毒、減少飼養(yǎng)人員在豬舍間流動(dòng)，同時(shí)提高飼養(yǎng)管理水平等；而疫苗接種主要是對(duì)豬群免疫接種PEDV相應(yīng)的弱毒或滅活疫苗。