莊金秋，梅建國，王 艷，苗立中，李 峰

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis, HPS）屬于巴斯德桿菌科（Pasteurellaceae）嗜血桿菌屬家族成員，是定植于豬上呼吸道的一種共棲菌[1]，也是一種條件性致病菌，在豬只免疫力低下或受到應激時會引起副豬嗜血桿菌病（又稱為格拉澤氏病，Glasser's disease）。該病在全球范圍內(nèi)廣泛流行，常引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、胸膜炎和腦膜炎等。主要影響2周齡到4月齡的青年豬，死亡率較高，是當前我國養(yǎng)豬業(yè)的重要細菌性疾病之一，常與病毒性疾病、免疫抑制性疾病發(fā)生混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[2]。目前HPS有15個血清型，不同血清型菌株之間存在強毒力、中等毒力和無毒力等顯著差異，且各血清型之間交叉保護力弱，疫苗的免疫效果較差，從而加重了副豬嗜血桿菌病的流行[3]。另外，HPS常與其他細菌或病毒混合感染，給獸醫(yī)臨床診斷也帶來了困難。因此，迫切需要建立HPS的快速檢測技術(shù)。本文簡要概述了副豬嗜血桿菌的最新實驗室檢測技術(shù)研究進展，以期為HPS的早期快速檢測、流行病學調(diào)查和有效防控提供參考。

1 細菌分離與鑒定

HPS是一種多形態(tài)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型、不運動的革蘭氏陰性短小桿菌。對HPS的分離培養(yǎng)和生化鑒定是HPS診斷的金標準。然而該菌的分離培養(yǎng)較為困難，對病料、采集時間、培養(yǎng)基等都有較高的要求。一般應選取臨床癥狀典型且未經(jīng)抗生素治療的病豬，無菌條件下采集病豬肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液、心包液和腦脊液等組織新鮮病料，接種于含1.5%NAD和5%血清的巧克力瓊脂培養(yǎng)基或TSA等培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)[4]，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，可以觀察到針尖大小、圓形、光滑濕潤、灰白色半透明或無色透明、邊緣整齊的露珠樣小菌落。挑取單個菌落涂片后進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察可見革蘭氏陰性短小桿菌。葡萄球菌可產(chǎn)生V因子，需V因子的HPS可在其周圍生長呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”。挑取單個菌落水平劃線接種于不含NAD的綿羊鮮血平板上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察其在葡萄球菌周圍生長情況，應出現(xiàn)“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”且無溶血現(xiàn)象。對分離到的疑似菌株還必須進行生化試驗鑒定，HPS可分解蔗糖和尿素，不分解乳糖、甘露醇和麥芽糖，對葡萄糖發(fā)酵不穩(wěn)定，醋酸鉛試驗呈陰性，硝酸鹽還原試驗呈陽性。尹秀鳳等（2004）[5]率先開展了HPS的分離與鑒定。細菌分離鑒定特異性較強，但操作復雜，費時費力，無法滿足臨床大量樣本快速檢測的要求。

2 血清學方法

2.1 補體結(jié)合試驗（CF）

Takahashi等（2001）[6]用CF試驗來評價以HPS血清2型和血清5型為抗原的二價疫苗免疫后的效果，在二次接種19 d后檢測陽性抗體效價，證實該方法敏感、特異，但是沒有評價交叉反應。CF的參與成分多、影響因素復雜，雖然HPS在疾病過后特異性抗體效價被識別，但是不同的血清型之間有廣泛的交叉反應，無法區(qū)分待檢HPS血清型。

2.2 間接血凝試驗（IHA）

魏子貢等（2006）[7]將HPS血清4型和血清5型分離菌株經(jīng)超聲波破碎處理后的產(chǎn)物致敏醛化綿羊紅細胞建立IHA方法。應用該方法對免疫豬群的抗體水平進行檢測，免疫豬群兩周后抗體檢出率達89%。其敏感性為瓊脂擴散試驗（AGP）的16倍。石碧等（2007）[8]提取了HPS血清5型菌株的莢膜多糖（CPS），并以之為抗原建立了IHA方法，通過優(yōu)化CPS產(chǎn)生的最適體外培養(yǎng)條件，得到了高質(zhì)量的抗原，從而使抗體檢測的敏感性得到了大幅提高。徐引弟等（2011）[9]選用HPS的血清4型、5型和13型3種血清型為抗原建立了IHA方法。IHA雖有較高的敏感性，但特異性不太強，而且操作步驟繁瑣、穩(wěn)定性差，阻礙了其在HPS臨床檢測上的推廣應用。

2.3 平板凝集試驗（PAT）

高艷等（2015）[10]利用副豬嗜血桿菌陜西分離株制備平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制備血清抗體，建立HPS的平板凝集試驗檢測方法，并用此方法對陜西部分地區(qū)豬場的豬進行了HPS血清抗體檢測，其檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果基本一致。PAT方法具有簡便、快速、經(jīng)濟、準確等優(yōu)點，常用于評估HPS疫苗免疫的抗體水平，但該法只能做定性檢測，且易受檢疫現(xiàn)場環(huán)境因素影響而出現(xiàn)非特異性反應，因此僅適用于集約化豬場和散養(yǎng)豬HPS的現(xiàn)場檢疫或初步篩查。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA既可以檢測抗原，也可以檢測抗體，具有簡便、快速、特異性強、敏感性高等優(yōu)點，可同時檢測大量樣品，適用于副豬嗜血桿菌病的血清抗體檢測和血清流行病學調(diào)查。建立該方法所選擇的包被抗原有滅活全菌體、莢膜多糖、超聲破碎抗原等。王艷等（2006）[11]選用甲醛滅活的全菌體作為包被抗原建立了檢測HPS抗體的間接ELISA方法，具有較好的試驗效果。全菌體抗原制備簡便，但存在成分復雜、抗原釋放不全等因素。采用全菌體抗原的陰性本底略微偏高，檢測結(jié)果不太穩(wěn)定并且經(jīng)常出現(xiàn)假陰性。石碧等（2007）[8]以HPS血清5型菌株的莢膜多糖作為抗原建立了間接ELISA檢測方法，敏感性是IHA的5～10倍。劉娜（2008）[12]分別以HPS全菌體抗原和超聲波破碎抗原作為包被抗原建立兩種間接ELISA方法，經(jīng)對四川省和重慶市的4個豬場的162份血清進行檢測，其結(jié)果與IHA的符合率分別為98.15%和97.53%。鄭念廣等（2011）[13]將121 ℃高溫高壓處理HPS血清4型和血清5型耐熱蛋白混合作為包被抗原，建立了檢測HPS抗體的間接ELISA方法。馮小明等（2009）[14]、馬福利等（2015）[15]先后將HPS血清5型分離株菌體超聲裂解，取上清液作ELISA包被抗原，建立了HPS抗體間接ELISA方法，可用于副豬嗜血桿菌病的檢疫和流行病學調(diào)查。

鑒于全菌體抗原成分復雜，可能會影響檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，同時存在散毒危害。超聲波破碎后的HPS菌體上清液抗原成分盡管沒有全菌體復雜，但并不單一。為消除無關(guān)抗原給間接ELISA方法的抗體檢測結(jié)果帶來不準確性，研究人員選用抗原成分單一且安全性較好的HPS蛋白作為包被抗原。故近年來，國內(nèi)有使用外膜蛋白（OmpP2、OmpP5、OmpP16）、寡肽通透酶蛋白（OppA）和HPS細胞致死膨脹毒素（CDT）等大腸桿菌表達的蛋白作為包被抗原建立的ELISA檢測方法。外膜蛋白OMP是HPS的主要毒力因子之一，是檢測HPS的候選抗原。李鵬等（2011）[16]、賈愛卿等（2011）[17]、李淼等（2011）[18]分別以HPS的重組OmpP2作為包被抗原建立間接ELISA方法，成功用于臨床HPS抗體的檢測。陳善真等（2011）[19]、臧瑩安等（2012）[20]分別利用表達純化的HPS的OmpP5作為包被抗原，建立了檢測HPS抗體的間接ELISA方法。宋帥等（2016）[21]以O(shè)mpP5的特異性單克隆抗體作為捕獲抗體、HPS的兔多克隆抗體作為檢測抗體，建立了檢測HPS抗原的雙抗體夾心ELISA檢測方法，可對臨床樣品進行快速、準確的檢測。鄭新添等（2018）[22]以HPS外膜蛋白OmpP16為包被抗原建立了檢測HPS抗體的間接ELISA方法。車勇良等（2013）[23]利用HPS重組OppA建立的間接ELISA抗體檢測方法，具有良好的特異性和穩(wěn)定性。盡管HPS具有多種血清型，但是所有血清型均能合成CDT，該毒素包括3個亞基CdtA、CdtB和CdtC。劉雙紅等（2016）[24]以CdtB為包被抗原，石保秋（2019）[25]以CdtC為包被抗原，分別建立了檢測HPS抗體的間接ELISA方法，均獲得較好的臨床檢測效果。王雷（2011）[26]將OmpP5、CdtA、CdtB、CdtC 4種蛋白混合作為包被抗原，以此建立的間接ELISA方法與全菌體抗原包被的間接ELISA方法之間，抗體檢測結(jié)果無顯著差異。應用上述蛋白建立的ELISA方法均優(yōu)于全菌體抗原作為包被抗原建立的方法，然而胸膜肺炎放線桿菌有與外膜蛋白OmpP2同源的蛋白（42%～71%氨基酸一致性），大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌和耶爾森菌等都有與的OppA同源的蛋白（55%～57%氨基酸一致性），大腸桿菌有與HPS的CdtB結(jié)構(gòu)和功能相似的同源蛋白（44%氨基酸一致性）。其它適用于包被抗原的HPS蛋白也相繼被報道。朱曉明等（2015）[27]以錳依賴的超氧化物歧化酶（MSD）作為包被抗原，建立了HPS間接ELISA檢測方法，但該方法只能保證對HPS的4、5和12血清型進行準確檢測。王正皓（2018）[28]以YfeA蛋白為包被抗原，劉俊琦（2020）[29]以Neu蛋白為包被抗原，劉曉露等（2021）[30]以重組表達的HPS轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A（TbpA）為包被抗原，分別建立了檢測HPS抗體間接ELISA方法，其臨床應用效果優(yōu)于全菌體抗原包被建立的間接ELISA抗體檢測方法。黏附素蛋白（Apd）為HPS所特有的一種位于細菌表面的蛋白，在HPS的15個血清型菌株和不能分型菌株中都含有該蛋白，而在其他相關(guān)豬的細菌性病原中沒有同源或類似蛋白。田楊等（2020）[31]建立了針對Apd蛋白的ELISA抗體檢測方法，用于HPS滅活疫苗免疫后的抗體檢測和HPS疾病的血清檢測。采用HPS具有高度保守性的主要結(jié)構(gòu)性功能蛋白用于建立間接ELISA抗體檢測方法，不僅成分單一，避免無關(guān)抗原干擾結(jié)果的穩(wěn)定性，而且安全性好，不存在散毒的危險，可成為理想中的包被抗原。

2.5 免疫組化（IHC）

Amano等（1997）[32]利用IHC方法在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中檢測到了HPS抗原。IHC方法能夠在HPS受感染組織中直觀地展現(xiàn)出細菌抗原的存在，但因該方法所使用的多克隆抗體會與其他細菌如豬胸膜肺炎放線桿菌等產(chǎn)生交叉反應，而在臨床診斷HPS感染時存在一定的局限性。

3 分子生物學方法

3.1 PCR

PCR技術(shù)具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，同時克服了培養(yǎng)困難、血清學檢測易發(fā)生交叉反應的缺點，已被廣泛應用于HPS病原體的檢測。林雪玲等（2006）[33]建立的PCR方法不僅可從初代分離培養(yǎng)物中對HPS進行鑒定和感染確診，而且可以直接對病料進行PCR檢測。米豐泉等（2005）[34]在已經(jīng)建立的豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）、豬多殺性巴氏桿菌（PM）、HPS的單項PCR方法的基礎(chǔ)上，成功地建立了APP、PM、HPS的復合PCR方法，對臨床上進行這3種疾病的鑒別診斷和混合感染的檢測都具有重要意義。目前已經(jīng)建立的HPS分子生物學檢測方法主要針對16S rRNA、infB、OmpP2、PILA、LIPO等基因，其中16S rRNA、infB是最常用的檢測靶標基因。16S rRNA基因在細菌各種屬之間具有高度保守性，被廣泛用于細菌之間的種屬鑒定。周勇岐等（2007）[35]、張盼鋒等（2009）[36]、萬世平等（2009）[37]、劉建奎等（2012）[38]、馬超鋒等（2017）[39]先后根據(jù)HPS的16S rRNA基因為模板設(shè)計引物，建立了PCR檢測方法，可用于臨床快速檢測HPS。李鵬等（2010）[40]針對HPS的OmpP2基因設(shè)計引物建立PCR方法，敏感性達到了1 000個HPS。吳靜波等（2016）[41]根據(jù)HPS的P2蛋白基因和豬鼻支原體（Mhr）的P37蛋白基因分別設(shè)計了1對引物，建立HPS和Mhr雙重PCR檢測方法，檢測靈敏度可達到100 copies，實現(xiàn)了HPS和Mhr的同時、快速、準確診斷，有利于疾病的后續(xù)治療和疫情的控制，為HPS和Mhr的準確診斷和有效防控了提供有力的技術(shù)支持。梁喬等（2018）[42]根據(jù)HPS的轉(zhuǎn)錄起始因子infB基因設(shè)計引物建立PCR方法，能檢測到的最低DNA濃度為18.1×10-6μg/mL。PILA和LIPO是HPS的外毒素基因。朱新貴等（2018）[43]根據(jù)HPS的16S rRNA、PILA、LIPO基因保守序列和的16S rRNA、KMT1基因保守序列，同時建立了雙重及多重PCR方法，可用于HPS和PM的臨床快速診斷。

3.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR技術(shù)比PCR具有更高的檢測特異性與敏感性，而且具有定量準確、全封閉反應等優(yōu)點，已被廣泛用于動物疫病檢測。于江等（2010）[44]、苗立中等（2012）[45]先后根據(jù)infB基因序列建立了檢測HPS的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法，敏感性是常規(guī)PCR的100倍。羅寶正等（2011）[46]根據(jù)infB基因序列，建立了TaqMan探針熒光定量PCR方法，與細菌分離方法的檢測效果一致。李軍等（2011）[47]根據(jù)16S rRNA基因序列建立了快速定量檢測HPS的實時熒光定量PCR方法，檢測的最低限度是50 copies/μL。張林海（2012）[48]、崔沛等（2018）[49]先后根據(jù)HPS 16S rRNA基因序列設(shè)計引物和TaqMan-MGB熒光探針，建立了HPS的熒光定量PCR檢測方法。靈敏度可達1.98×101copies/μL。李富祥等（2013）[50]根據(jù)HPS的16S rRNA基因建立了TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法，其靈敏度為6.92×101copies/μL，可用于HPS感染的早期快速檢測、定量分析以及流行病學調(diào)查。姜睿姣等（2019）[51]根據(jù)HPS的OmpP2基因序列和PM的PlpE基因序列分別設(shè)計了特異性引物和探針，建立了一種能同時檢測HPS和PM的雙重熒光定量PCR方法。熒光定量PCR方法特異性強、敏感性高、重復性好、耗時短，使得其在臨床應用上能夠在較短的時間排查病原，具有較大的應用價值。

3.3 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR是近十年來興起的第3代PCR技術(shù)，該方法采用直接計數(shù)目標分子數(shù)而不依賴任何校準物或外標，通過計數(shù)單個分子從而實現(xiàn)絕對定量。與實時熒光定量PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有精準、靈敏度超高和不易受PCR抑制物影響等優(yōu)點。數(shù)字PCR的建立為HPS檢測和流行病學調(diào)查提供了新的方法和借鑒。石磊等（2018）[52]根據(jù)HPS的OmpP2基因設(shè)計引物和TaqMan探針，建立了可對其準確定量的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）檢測方法，并與熒光定量PCR檢測方法進行了比較分析。結(jié)果表明ddPCR具有敏感性高、特異性好等優(yōu)點，最低可檢測到2.647 copies/μL的陽性質(zhì)粒，靈敏度和實際檢出率均高于熒光定量PCR，可用于HPS低含量樣品檢測和定量檢測。數(shù)字PCR技術(shù)也存在一些不足，如檢測所需時間較長，是熒光定量PCR的2～3倍；檢測樣本需要稀釋到一定濃度才可檢測；單個樣本檢測成本高于熒光定量PCR，所需儀器設(shè)備昂貴等。

3.4 環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術(shù)

LAMP技術(shù)是一種核酸等溫擴增技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟等特點，非常適合基層的臨床檢測和進出口岸的通關(guān)檢測。朱杰儀等（2010）[53]、吳詩敏等（2010）[54]、侯魁等（2017）[55]、劉亞娟等（2018）[56]、李璐璐等（2020）[57]先后根據(jù)HPS的16S rRNA基因設(shè)計引物，建立了LAMP方法，檢測靈敏度是常規(guī)PCR的100倍以上。魏曉媛（2013）[58]根據(jù)OmpP2基因建立了LAMP方法，其最低檢測DNA量為0.2 pg/μL。車勇良等（2013）[23]根據(jù)HPS肽聚糖相關(guān)脂蛋白（PalA）基因序列設(shè)計引物，在反應后的體系中加入SYBR Green I，建立了可視化LAMP檢測方法。整個反應只需要在55 ℃水浴1 h即可，反應結(jié)束后只需向反應液中加入熒光染料，通過肉眼就能辨別檢測結(jié)果。Zhang等（2012）[59]根據(jù)infB基因建立了HPS的LAMP方法，檢測限為10 CFU/mL。Gou等（2018）[60]根據(jù)HPS的wzs5基因建立的交叉引物擴增核酸試紙條檢測方法，60 ℃恒溫反應1 h，即可通過帶有垂直流可視化的反應條帶，可對14 CFU/mL以上的HPS進行檢測。劉博婷等（2018）[61]根據(jù)HPS的infB基因和豬鏈球菌2型（SS2）的Cps2j基因各設(shè)計1套LAMP引物，建立了HPS與SS2的雙重LAMP檢測方法，可實現(xiàn)兩種病原的同步快速檢測。李忍等（2021）[62]根據(jù)HPS血清4型脂多糖合成蛋白基因wcip4和血清13型糖脂轉(zhuǎn)移蛋白基因gltP序列設(shè)計引物，分別建立了快速鑒定HPS血清4型和血清13型的LAMP方法，基因組DNA檢測限分別為1 pg/μL和2.5 pg/μL。到目前為止，LAMP技術(shù)與PCR方法相比，成本低廉，不需要昂貴的儀器設(shè)備，是檢測HPS所需時間最短的一種檢測方法，但在實際操作中，由于其靈敏度高，以致開蓋后容易造成氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。而且由于LAMP的結(jié)果主要通過肉眼對液體的濁度和熒光亮度進行判定，存在一定的主觀性，不利于可疑樣品的精確判斷。

3.5 原位雜交（ISH）

Jung等（2004）[63]研發(fā)了ISH方法，應用該方法檢測了HPS的基因組序列。ISH優(yōu)點高于IHC，能夠直接展示出HPS與組織損傷之間的關(guān)系，能避免特異性抗體有效性的問題。然而，HPS的16S rRNA基因探針與豬胸膜肺炎放線桿菌極為相似，在檢測時可能有交叉反應。而且ISH技術(shù)要求高，且需要特定的設(shè)備，價格昂貴，不適用于開展大規(guī)模的流行病學調(diào)查和快速診斷。

4 小結(jié)

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，副豬嗜血桿菌病的流行越來越廣泛，已經(jīng)成為呼吸道病綜合征中的重要疾病，對豬的危害日趨嚴重。該病防控的關(guān)鍵在于及時確診并采取相應的防治措施。根據(jù)該病的流行病學特點、主要臨床癥狀及解剖病變作出初步診斷后再結(jié)合實驗室檢測技術(shù)，可對該病確診。另外，快速敏感的檢測技術(shù)不僅對于及時采取措施防控疫情蔓延等至關(guān)重要，還能及早發(fā)現(xiàn)新菌株、最終菌株的演化，找出最危險的病原菌并開發(fā)相關(guān)疫苗，在防控疫情時掌握主動。上述HPS的實驗室檢測方法多種多樣，技術(shù)在不斷的革新和完善，但是每種方法均具有各自的優(yōu)缺點和實用性，在實際應用中應根據(jù)具體情況選擇適宜的方法。相信隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，HPS的檢測會向著更加敏感、特異、快速、簡便、高效的方向發(fā)展，并在綜合防控與凈化中發(fā)揮重要作用，從而達到根除疾病的目的。