毛佳琦，鄭允允，張二強(qiáng)，王 培，付玉潔，王 瑤

（1.浙江大學(xué)中原研究院，河南 鄭州 450001；2.陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，陜西 寶雞 721013）

【研究意義】碳的兩種穩(wěn)定性同位素12C 和13C 因原子質(zhì)量不同而使其在分解速率、化學(xué)鍵能強(qiáng)度、氣相中傳導(dǎo)速率等物理化學(xué)性質(zhì)上具有差異性，從而導(dǎo)致植物體生物化學(xué)反應(yīng)前后碳同位素組成（δ13C）的改變，即同位素分餾［1］。C3 植物的δ13C 值分布在-22‰～-35‰，該值與植物生理特征、遺傳特性、生長(zhǎng)環(huán)境、光合作用類型等多種因素密切相關(guān)［2］。煙葉屬C3 植物，是一種對(duì)生態(tài)環(huán)境較為敏感的經(jīng)濟(jì)作物，在烤煙種植過程中生態(tài)環(huán)境的差異會(huì)對(duì)葉片的光合速率、水分利用效率和氣孔開閉等各種生理狀態(tài)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致不同生態(tài)種植區(qū)煙葉δ13C 值存在差異?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】煙葉13C 值受非生物因素如水分、溫度、光強(qiáng)和光質(zhì)、土壤鹽分、CO2濃度、海拔高度、經(jīng)度、緯度等和生物因素如煙葉部位、葉片成熟期、葉片結(jié)構(gòu)等多種因素影響，因此，煙葉δ13C 值是煙葉種植產(chǎn)地氣候環(huán)境信息和其內(nèi)部復(fù)雜生理生態(tài)過程的綜合表征［2-4］。不同生態(tài)種植區(qū)的煙葉由于氣候環(huán)境條件影響，導(dǎo)致不同種植區(qū)煙葉δ13C 值存在差異。自20 世紀(jì)50 年代發(fā)現(xiàn)不同植物間穩(wěn)定碳同位素組成存在差異以來［5-6］，隨著質(zhì)譜測(cè)定技術(shù)發(fā)展，穩(wěn)定碳同位素技術(shù)在植物水分利用效率、光合作用途徑、植物群落水平、樹木年輪、土壤-植物碳循環(huán)、植物對(duì)氣候變化響應(yīng)和適應(yīng)、農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源等方面得到廣泛應(yīng)用［7-12］，在生理生態(tài)學(xué)領(lǐng)域主要用于研究穩(wěn)定碳同位素組成的小范圍變化與作物品種差異的關(guān)系及環(huán)境因子對(duì)植物穩(wěn)定碳同位素組成的影響［13-14］。而煙葉穩(wěn)定碳同位素的研究起步相對(duì)較晚且相關(guān)報(bào)道較少，主要集中在煙葉δ13C 值與其生理品質(zhì)特征、化學(xué)成分的關(guān)系等方面［3,15-16］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于煙葉穩(wěn)定碳同位素組成與葉位和經(jīng)緯度的關(guān)系及不同香型的烤煙碳同位素組成的差異等方面鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過探索煙葉穩(wěn)定碳同位素組成與葉位關(guān)系并進(jìn)行橫向、縱向（緯度、經(jīng)度）對(duì)比，探討分析煙葉穩(wěn)定碳同位素組成的受控因素，以及碳同位素組成對(duì)不同香型煙葉的聚類差異，以期為煙草種植評(píng)價(jià)指標(biāo)體系的完善及生態(tài)適應(yīng)性機(jī)理研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

按《中國煙草種植區(qū)劃》［17］中劃分的一級(jí)煙草種植區(qū)選取其中4 個(gè)種植區(qū)為研究區(qū)域，分別為西南煙草種植區(qū)（云南、貴州等地）、東南煙草種植區(qū)（江西、福建等地）、長(zhǎng)江中上游煙草種植區(qū)（重慶、湖北、湖南等地）和黃淮煙草種植區(qū)（陜西、河南等地）。按照煙葉著生部位不同分別隨機(jī)選取384 株不同產(chǎn)地的煙田中達(dá)到生理成熟期的煙草植株的上部煙葉（自下而上第3～5 葉位葉片）、中部煙葉（自下而上第9～11 葉位葉片）和下部煙葉（自下而上第15～17 葉位葉片）為試驗(yàn)材料，樣品涉及14 個(gè)二級(jí)劃分區(qū)9 個(gè)省24 個(gè)地市，具有分布范圍廣、類型全、數(shù)量多等特點(diǎn)，具有一定的代表性。采集后的樣品用蒸餾水洗凈后截取每片葉片的中心部位（同一片葉子的中間部位是氣孔密度和氣孔指數(shù)最穩(wěn)定的區(qū)域［18］）于70℃烘干，粉碎后過178 μm 篩備檢。

1.2 試驗(yàn)方法

穩(wěn)定碳同位素組成測(cè)定：處理后的樣品在高純氧氣條件下經(jīng)高溫充分燃燒后生成CO2，提取燃燒產(chǎn)物CO2，采用Flash2000-MAT253 同位素分析儀（美國ThermoFisher 公司）測(cè)定穩(wěn)定碳同位素比率，分析結(jié)果參照國際標(biāo)準(zhǔn)（Pee Dee Belnite或PDB），根據(jù)如下公式計(jì)算：

式中，δ13C 表示煙葉穩(wěn)定碳同位素組成；(13C/12C)PDB表示南卡羅來納州白碚石中的13C/12C。

檢測(cè)條件：標(biāo)準(zhǔn)樣品IAEA-600（caffeine，δ13CV-PDB=-27.771‰±0.043‰，δ15Nair=-1.0‰±0.2‰），氧化溫度960 ℃，載氣流速100 mL/min，氧氣流速280 mL/min。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖表采用OriginPro8.5 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉穩(wěn)定碳同位素組成隨經(jīng)緯度分布情況

基于全球尺度對(duì)植物的生長(zhǎng)研究發(fā)現(xiàn)，隨著經(jīng)緯度變化，在各種環(huán)境因子如溫度、降水的影響下，植物形成了對(duì)環(huán)境變化的不同響應(yīng)，δ13C 值與經(jīng)緯度具有一定相關(guān)性［19-20］。本研究所選取的樣本種植區(qū)覆蓋99°17′E～118°26′E、23°88′N～35°53′N，東西跨越19 個(gè)經(jīng)度，南北跨越12 個(gè)緯度，樣本δ13C 值分布范圍為-27.76‰～-25.39‰，平均值為-26.46‰。

2.1.1 煙葉δ13C 值隨經(jīng)度的變化 如圖1 所示，在99°17′E～118°26′E 范圍內(nèi)，煙葉δ13C 值呈現(xiàn)隨經(jīng)度增加而逐漸減小的趨勢(shì)，δ13C 值與經(jīng)度之間呈極顯著負(fù)相關(guān)性，從地理位置上自西向東，經(jīng)度每增加1°，煙葉δ13C 值減小0.09‰。經(jīng)度變化本身并不會(huì)對(duì)植物δ13C 值產(chǎn)生影響，而是由于隨著地理位置變化而改變的環(huán)境因子（如溫度、降水等）造成植物δ13C 值空間分布的差異性［20-21］。

圖1 煙葉δ13C 值隨經(jīng)度的分布Fig.1 Distribution of δ13C values of tobacco leaves with longitude

我國氣溫和降水量分別呈現(xiàn)自西向東逐漸降低和梯度增加的特點(diǎn)，在99°17′E～118°26′E范圍內(nèi)，氣候呈現(xiàn)東面濕潤(rùn)、西面較干燥的特點(diǎn)，東部地區(qū)陰雨天時(shí)間較多，而西部地區(qū)天晴少雨的時(shí)間更長(zhǎng)。當(dāng)降水量減少時(shí)，水分脅迫加劇，土壤及空氣含水量降低，植物往往通過關(guān)閉部分氣孔來降低氣孔傳導(dǎo)速率，葉內(nèi)CO2濃度降低，對(duì)13C 的辨別力降低，葉片光合作用所固定的δ13C值增加［1］。而溫度升高同樣也會(huì)導(dǎo)致土壤水分蒸發(fā)加快從而降低土壤水分可利用量，使δ13C 值偏正。而個(gè)別經(jīng)度范圍如109°41′E～109°76′E，煙葉δ13C 值呈現(xiàn)略增大趨勢(shì)，這可能是該地域范圍內(nèi)其他環(huán)境因素協(xié)同作用的結(jié)果。

2.1.2 煙葉δ13C 值隨緯度的變化 試驗(yàn)結(jié)果顯示，在23°88′N～35°53′N 地區(qū)范圍之內(nèi)，煙葉δ13C 值與緯度之間無顯著線性相關(guān)性（圖2A），與一些C3 植物如艾蒿、藜、平車前等的δ13C 值與緯度呈顯著負(fù)相關(guān)性的研究結(jié)果有所不同［14］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在23°88′N～27°50′N 范圍內(nèi)，由南向北，煙葉δ13C 值由重逐漸變輕；在27°50′N～35°53′N 范圍內(nèi)，煙葉δ13C 值由南向北則呈現(xiàn)由輕逐漸變重的特征，整體呈現(xiàn)以N27°50′為谷底的“V”字型變化特征，采用二次曲線對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合（圖2B）后發(fā)現(xiàn)δ13C 值與緯度平方的回歸方程達(dá)到顯著水平，總體而言，煙葉δ13C 值表現(xiàn)出隨緯度增加先降后升的趨勢(shì)。

圖2 煙葉δ13C 值隨緯度的分布Fig.2 Distribution of δ13C values of tobacco leaves with latitude

2.2 不同葉位穩(wěn)定碳同位素組成差異

圖3 為4 個(gè)一級(jí)種植區(qū)不同葉位煙葉穩(wěn)定碳同位素組成分布。長(zhǎng)江中上游種植區(qū)煙葉δ13C 值在-28.05‰～-25.28‰之間，均值為-26.74‰；黃淮種植區(qū)煙葉δ13C 值在-27.95‰～-24.70‰之間，均值為-25.94‰；東南種植區(qū)煙葉δ13C 值在-28.79‰～-25.65‰，均值為-27.19‰；西南種植區(qū)煙葉δ13C 值在-27.50‰～24.90‰之間，均值為-25.93‰；西南種植區(qū)和黃淮種植區(qū)不同葉位的煙葉δ13C 值均顯著高于其余兩地?zé)熑~對(duì)應(yīng)葉位的δ13C 值，而西南和黃淮兩個(gè)種植區(qū)相同葉位的δ13C 值無顯著性差異。東南種植區(qū)上部、中部和下部葉片的δ13C 值在4 個(gè)種植區(qū)中均為最小值。4個(gè)種植區(qū)的煙葉δ13C值均隨葉位的升高而增大，下部葉片的δ13C 值較小，且同一地區(qū)不同葉位的δ13C 值有顯著性差異。這可能是由于土壤呼吸所釋放的CO2的δ13C 的平均值為-12‰～-25‰，而大氣中CO2的δ13C 平均值為-7.8‰，兩者之間存在較大差異，而靠近土壤的葉片較多的吸收更負(fù)的δ13C 值的CO2源，其δ13C 值減小，因此即使生長(zhǎng)在同一地區(qū)同一環(huán)境的煙葉，因CO2來源不同，不同葉位的煙葉內(nèi)部碳同位素組成也不同［22-23］。δ13C 值同時(shí)也表征了植物葉片在光合作用活躍期的平均光照狀況，該值偏低，說明葉片在生長(zhǎng)期接收光照較少，由此可以推斷煙葉上部葉片獲得的光照多于下部葉片，因而其葉片碳同位素組成高于下部葉片［4,24］。

圖3 4 個(gè)一級(jí)種植區(qū)煙葉δ13C 值隨葉位的分布Fig.3 Distribution of δ13C values of tobacco leaves with leaf position in four first class planting areas

2.3 穩(wěn)定碳同位素對(duì)煙葉的聚類分析

我國烤煙類型按照煙葉香型可以分為清甜香型、蜜甜香型、醇甜香型、焦甜焦香型、焦甜醇甜香型、清甜蜜甜香型、蜜甜焦香型、木香蜜甜香型等八大香型［25］。通過對(duì)不同產(chǎn)地不同香型煙葉的δ13C 值進(jìn)行聚類分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聚類距離＜5 時(shí)，樣本可以被分為三類：第一類為高δ13C 值，清香甜香型烤煙：臨滄烤煙、曲靖烤煙、玉溪烤煙、大理烤煙、昆明烤煙、保山烤煙、楚雄烤煙；第二類為較高δ13C 值，焦甜焦香型、清甜蜜甜香型和焦甜醇甜香型：渭南烤煙、銅川烤煙、南平烤煙、三明烤煙、龍巖烤煙和撫州烤煙；第三類為較低δ13C 值，焦甜醇甜香型、醇甜香型和蜜甜香型：韶關(guān)烤煙、郴州烤煙、湘西烤煙、安康烤煙、商洛烤煙、漢中烤煙、貴陽烤煙、遵義烤煙。當(dāng)聚類距離＜2 時(shí)，醇甜香型烤煙可單獨(dú)被分為一類為低δ13C 值：湘西烤煙、安康烤煙、商洛烤煙和漢中烤煙。

圖4 基于不同產(chǎn)地?zé)熑~的δ13C 值聚類結(jié)果Fig.4 Cluster results of tobacco leaves from different areas based on δ13C values

3 討論

植物碳同位素組成受多種生物因素和非生物因素的影響［2］，雖然植物組織內(nèi)的δ13C 值最終由生物因素決定，但生物因素受其生長(zhǎng)地區(qū)環(huán)境因子的影響，因而植物的碳同位素組成蘊(yùn)含其生理生態(tài)特征和環(huán)境信息［4］。煙草是一種適應(yīng)性廣且對(duì)生態(tài)環(huán)境條件十分敏感的經(jīng)濟(jì)作物，生態(tài)環(huán)境影響煙葉的品質(zhì)和香型，煙草品質(zhì)差異，“良由地氣使然也”［26-27］。本研究發(fā)現(xiàn)，在99°17′E～118°26′E 范圍內(nèi)，煙葉δ13C 值與經(jīng)度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，經(jīng)度每增加1°，煙葉δ13C值減小0.09‰，這與李嘉竹［14］對(duì)陸地C3、C4 草本植物的研究結(jié)果一致；在23°88′N～35°53′N地區(qū)范圍內(nèi)，煙葉δ13C 值與緯度之間呈一種非線性關(guān)系，通過二次曲線進(jìn)行擬合發(fā)現(xiàn)具有二次拋物線特征，即從整體來看煙葉δ13C 值表現(xiàn)出隨緯度增加先下降后上升趨勢(shì)。這與李嘉竹［14］研究的植物葉片碳同位素與緯度也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的結(jié)果不太相同，可能是由于煙葉δ13C 值受局部地區(qū)環(huán)境條件的影響。然而經(jīng)度和緯度并非是導(dǎo)致煙葉δ13C 差異的根本原因，環(huán)境因素如光照、降水、溫度、二氧化碳濃度等才是主要原因，不同經(jīng)、緯度地區(qū)的氣候條件和地理環(huán)境的差異導(dǎo)致煙葉碳穩(wěn)定同位素組成差異。通過對(duì)同一區(qū)域內(nèi)不同葉位煙葉δ13C 值研究發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)種植區(qū)不同葉位煙葉δ13C 值具有顯著差異，隨葉位升高而增大，表現(xiàn)為上部葉片＞中部葉片＞下部葉片，且同一地區(qū)不同葉位的δ13C 值有顯著性差異。這與王毅等［16］結(jié)論一致。西南種植區(qū)和黃淮種植區(qū)煙葉碳同位素組成較接近，顯著高于其他兩個(gè)種植區(qū)，而長(zhǎng)江中上游種植區(qū)和東南種植區(qū)的煙葉碳同位素組成較類似。最后，本研究以δ13C 值為變量，對(duì)不同產(chǎn)地不同香型烤煙進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，可以對(duì)清香甜香型和醇甜香型烤煙進(jìn)行有效聚類，而對(duì)焦甜焦香型、清甜蜜甜香型、焦甜醇甜香型和蜜甜香型4 種香型烤煙則沒有明顯的聚類效果，需要加入其他變量如氮同位素等進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究初步探明煙葉碳同位素組成與經(jīng)緯度、葉片以及烤煙香型的關(guān)系，但煙葉δ13C 值與烤煙品質(zhì)、香氣成分之間關(guān)系及對(duì)其生理指標(biāo)的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究分析了煙葉碳同位素組成與地理空間要素之間的關(guān)系，并利用碳同位素對(duì)不同香型進(jìn)行煙葉聚類分析，煙葉穩(wěn)定碳同位素組成與經(jīng)度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，經(jīng)度每增加1°，煙葉δ13C 值減小0.09‰；與緯度整體呈以北緯27°50′為谷底的“V”字型變化特征，擬合后呈二次拋物線關(guān)系，不同葉位煙葉穩(wěn)定碳同位素組成不同，利用δ13C 值可以對(duì)清香甜香型和醇甜香型烤煙進(jìn)行有效聚類。