陳兵先，張 琪，戴彰言，高家東，張文虎，吳柔賢，宋松泉，劉 軍

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】水稻是我國最重要的糧食作物之一。隨著我國農(nóng)業(yè)種植模式的改變和人工成本的不斷增加，直播稻越來越受青睞。然而，直播稻栽培因省去了浸種、育苗等常規(guī)流程，對于種子的活力有更高的要求。因此，在水稻直播前對種子活力及生活力進(jìn)行評判有助于優(yōu)選高活力種子，這對于確保田間萌發(fā)率和成苗率顯得尤為重要。

【前人研究進(jìn)展】種子活力是指在廣泛的田間條件下，種子能夠迅速、整齊地萌發(fā)并長成健壯幼苗的能力［1］。國際種子檢驗(yàn)協(xié)會（International Seed Testing Association，ISTA）將電導(dǎo)率測定和加速老化試驗(yàn)作為農(nóng)作物種子活力檢測的推薦方法。這些方法雖然可靠性高，但試驗(yàn)周期較長。種子的生活力是指種子的潛在發(fā)芽能力或種胚所具有的生命力，是種子預(yù)期能夠長成正常幼苗的潛在能力［2］。高活力的種子一定具有高的生活力，因此當(dāng)生產(chǎn)上不能應(yīng)用電導(dǎo)率測定和加速老化試驗(yàn)對種子活力進(jìn)行判定時，往往將四唑（Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）法檢測種子生活力的結(jié)果作為評判種子活力的重要依據(jù)［3］。用于種子生活力檢測的TTC 染色法具有便捷、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)［4］，ISTA 和中國農(nóng)作物檢驗(yàn)規(guī)程建議將TTC 染色法列為種子活力測定的方法之一。然而，TTC 染色法具有不穩(wěn)定、受制于種子類別和染色條件等特點(diǎn)，目前缺乏程序化、規(guī)范化的TTC 染色技術(shù)流程。因此，針對不同農(nóng)作物種子的特征特性，開發(fā)一套適用于不同類別作物種子的TTC 染色技術(shù)對于種子生活力的檢測具有重要意義。

【本研究切入點(diǎn)】以秈型常規(guī)水稻R988 為材料，針對當(dāng)前種子生活力檢測不規(guī)范、缺乏統(tǒng)一技術(shù)流程的現(xiàn)狀，以及種業(yè)市場對于種子生活力檢測的迫切需求，應(yīng)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)研究吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間對于種子生活力的影響；并通過萌發(fā)率和酶活性分析水稻種子萌發(fā)過程生理指標(biāo)的變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討水稻種子TTC 染色方法中對生活力測定有顯著影響的因素，并從各因素中篩選適用于水稻種子生活力檢測的最佳水平，揭示水稻種子在吸水萌發(fā)過程中的特性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

秈型常規(guī)水稻R988 于2020 年早造種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地。種子收獲后置于廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源庫干燥間（溫度15℃，濕度15%）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻種子TTC 染色 所用試劑為2,3,5－氯代三苯基四氮唑（購于廣州鼎國生物技術(shù)有限公司），溶解液為pH7.0 磷酸緩沖液，配制成不同濃度的TTC 染色液。將經(jīng)過凈度分析后飽滿的水稻種子去殼，于無菌水中預(yù)吸脹一定時間（100粒/重復(fù)），將預(yù)吸脹的種子撈出后用濾紙吸干表面水分，每100 粒種子加入30 mL TTC 染色液，在一定染色溫度下染色一定時間。染色結(jié)束后將種子用清水沖洗3 次，終止反應(yīng)。染色后的種子采用體視顯微鏡觀察。

單因素試驗(yàn)：設(shè)置單因素試驗(yàn)研究種子吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間對種子生活力的影響。（1）種子吸水時間試驗(yàn)：采用濃度為1%TTC、染色溫度30℃、染色時間1 h，種子吸水時間分別設(shè)置為0、3、6、9、12 h 對水稻種子進(jìn)行染色；（2）TTC 濃度試驗(yàn)：采用吸水時間6 h、染色溫度30℃、染色時間1 h，TTC 濃度分別設(shè)置為0.1%、0.2%、0.5%、1%和2%對水稻種子進(jìn)行染色；（3）染色溫度試驗(yàn)：采用吸水時間6 h、1% TTC、染色時間1 h，染色溫度分別設(shè)置為20、25、30、35、40℃對水稻種子進(jìn)行染色；（4）染色時間試驗(yàn)：采用吸水時間6 h、1%TTC、染色溫度30℃，染色時間分別設(shè)置為0.5、0.75、1、1.5、2 h 對水稻種子進(jìn)行染色。種子生活力按以下公式計(jì)算：

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取種子吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間作為影響種子生活力測定準(zhǔn)確性的主要因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（表1），進(jìn)一步優(yōu)化水稻種子TTC 染色檢測方法。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.2 水稻種子萌發(fā)特性分析（1）種子萌發(fā)率測定：將每100 粒水稻種子置于9 cm×9 cm發(fā)芽盒中萌發(fā)，盒內(nèi)鋪平兩層濾紙，加入20 mL無菌水。將發(fā)芽盒置于植物培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為28℃、濕度為85%、光照強(qiáng)度為10 000 lx，光照和黑暗時長分別為16 h 和8 h。本試驗(yàn)分析不同水量、溫度、光暗條件對水稻種子萌發(fā)的影響，只需改變某單一試驗(yàn)條件，其他萌發(fā)條件均保持不變。種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)為胚根≥2 mm。計(jì)算種子萌發(fā)率。

（2）種子生理指標(biāo)測定：取吸脹48 h 的水稻種子胚，4 次重復(fù)，每個重復(fù)100 粒。淀粉酶活性測定參照《作物種子生理學(xué)實(shí)驗(yàn)》［5］、可溶性糖含量測定參照《種子學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》［6］的方法進(jìn)行。

采用Microsoft office 軟件和SPSS21 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻種子TTC 染色的差異分析

采用去除穎殼的水稻整粒種子進(jìn)行TTC 染色，結(jié)果（圖1）只有種胚處被染色，而胚乳（包括糊粉層和淀粉型胚乳）均不能被染色。種胚被染色的種子主要分為5 種情況：整個胚染色較深、整個胚染色較淺、胚根被染色、胚芽被染色、盾片被染色。將種子沿種胚對稱縱切后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前4 種狀態(tài)下的種子其整個胚均能被較深程度地染色；而整粒未能被染色的種子以及僅盾片處被染色的種子，縱切半粒后的種胚也不能被染色。

圖1 水稻種子TTC 染色效果Fig.1 TTC staining effects of rice seeds

2.2 水稻種子TTC 染色單因素試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，種子染色前的吸水時間對種子染色率有較大影響。種子吸水時間0 h，即干種子時，染色率僅為53%，吸水種子的染色率明顯高于干種子的染色率，吸水3 h 以上的染色率均大于70%，吸水12 h 的染色率達(dá)到80%。

表2 胚染色率與種子吸水時間的關(guān)系Table 2 Relationship between staining rate of embryo and seed imbibition time

由表3 可知，TTC 濃度對于染色率也有較大影響，主要體現(xiàn)在高低濃度的差別上，當(dāng)TTC濃度≤0.2%時染色率不足60%，但當(dāng)TTC 濃度≥0.5%時染色率沒有顯著差異，均在80%以上。

表3 胚染色率與TTC 濃度的關(guān)系Table 3 Relationship between staining rate of embryo and TTC concentration

表4 結(jié)果表明，染色溫度為20℃時，種子染色率僅為43%，隨著染色溫度的上升種子染色率也逐漸升高，但當(dāng)溫度高于30℃時染色率升高趨勢趨緩。

表4 胚染色率與染色溫度的關(guān)系Table 4 Relationship between staining rate of embryo and staining temperature

表5 結(jié)果表明，種子染色時間可能對于染色率的影響更大，從染色0.5～2 h 這一過程中可見，染色率呈現(xiàn)直線上升的趨勢。

表5 胚染色率與染色時間的關(guān)系Table 5 Relationship between staining rate of embryo and staining time

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，我們選用種子吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素，并從單因素的多個試驗(yàn)梯度中各選用3 個水平，以期篩選最佳的染色組合方案。

2.3 水稻種子TTC 染色正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6 可知，在不同因素與水平組合處理下，水稻種子染色率（種子生活力）介于52%～95%之間，存在較大差異。其中以第4 組合試驗(yàn)即吸水時間6 h、0.5% TTC、染色溫度30℃和染色時間2 h 條件下的種子生活力最高，種胚完全染色占72.5%，種胚染色較淺或僅胚根、胚芽染色占22.5%，總?cè)旧矢哌_(dá)95%，明顯優(yōu)于其他組合；而第1 組合試驗(yàn)即吸水時間3 h、0.5%TTC、染色溫度25℃、染色時間0.5 h 條件下的種子生活力最低，能夠完成染色的種子數(shù)僅為15%，大部分為不能染色和染色較淺的種子。對各試驗(yàn)組得到的染色率進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，試驗(yàn)設(shè)定的4 個因素，吸水時間（A）和TTC 濃度（B）的P值分別為0.036 和0.024，說明吸水時間和TTC 濃度對種子染色結(jié)果有顯著作用；而染色溫度（C）和染色時間（D）的P值均小于0.01，達(dá)到極顯著差異水平，表明這兩個因素對于種子染色結(jié)果有更重要的作用。

表6 水稻種子TTC 染色正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of orthogonal test for TTC staining of rice seeds

進(jìn)一步對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，結(jié)果表明，4 個因素的極差值分別為RA=2.9，RB=3.1，RC=17.5，RD=26.8。因此，4 個因素對于水稻種子生活力的影響依次為：染色時間（D）＞染色溫度（C）＞TTC 濃度（B）＞吸水時間（A）。可見在利用TTC 方法對水稻種子進(jìn)行染色時，染色時間最為重要，而種子吸水時間影響最小。由于各因素所對應(yīng)極差的最大值可代表最適合測定水稻種子生活力的條件，綜合上述結(jié)果，則可以得出水稻種子染色的最佳條件為：吸水時間3 h、TTC 濃度1%、染色溫度30℃、染色時間2 h。利用該最佳組合對同一批水稻種子染色，平均染色率為95.5%，稍高于正交試驗(yàn)中的最佳試驗(yàn)組合。

2.4 不同萌發(fā)條件下水稻種子萌發(fā)率變化

溫度、水分、光照和氧氣是決定種子萌發(fā)最重要的因素［7］。由圖2 可見，水稻種子在35℃下萌發(fā)最快，25℃下萌發(fā)最慢，種子萌發(fā)4 d（96 h）的萌發(fā)率分別為82%和72%。不同溫度條件并未對萌發(fā)7 d（168 h）的萌發(fā)率產(chǎn)生顯著影響，25～35℃下的萌發(fā)率均超過90%。

圖2 水稻種子在不同溫度下的萌發(fā)率Fig.2 Germination rate of rice seeds at different temperature

圖3 結(jié)果表明，光照對于水稻種子萌發(fā)的影響在萌發(fā)48 h 前未產(chǎn)生顯著影響，之后萌發(fā)過程被光促進(jìn)，萌發(fā)率在暗條件下略有降低，表明光照條件可以加速水稻種子萌發(fā)。

圖3 水稻種子在光照和黑暗條件下的萌發(fā)率Fig.3 Germination rate of rice seeds under light or dark conditions

種子吸水是完成萌發(fā)最關(guān)鍵的先決條件，水量多少決定種子的萌發(fā)速率和質(zhì)量，比如大豆種子萌發(fā)不需要太多水分，浸種次數(shù)越多反而萌發(fā)率降低［8］。研究表明，水稻種子隨著水量的增加，萌發(fā)速率和萌發(fā)率逐漸升高（圖4），這可能是由于水稻的水生特性所決定的。

圖4 水稻種子在不同水量條件下的萌發(fā)率Fig.4 Germination rate of rice seeds imbibed in different water amounts

2.5 不同萌發(fā)條件下水稻種子淀粉酶活性和可溶性糖含量變化

水稻的淀粉酶是一類水解種子內(nèi)淀粉，并參與赤霉素轉(zhuǎn)運(yùn)的重要水解酶，一向被認(rèn)為與水稻種子萌發(fā)密切相關(guān)［9］。在不同溫度下吸脹萌發(fā)時，α-淀粉酶的活性隨著溫度上升逐漸升高，β-淀粉酶活性在25℃和30℃時無顯著差異，相比之下，35℃萌發(fā)溫度卻顯著提高了β-淀粉酶在種子胚中的活性（圖5）。與黑暗環(huán)境下萌發(fā)的種子相比，光照顯著提高了水稻種子胚中α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性（圖6）。在10、20 mL 水中吸脹的水稻種子，α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性沒有明顯變化，然而隨著水量的逐漸增加，兩種淀粉酶的活性也逐漸升高（圖7）。不同吸脹條件下，淀粉酶活性的變化趨勢與水稻種子萌發(fā)率的變化幾乎一致，表明α-淀粉酶和β-淀粉酶是參與水稻種子萌發(fā)的關(guān)鍵水解酶。

圖5 水稻種子在不同溫度下萌發(fā)48 h 的胚中淀粉酶活性Fig.5 Amylase activity in embryos of rice seeds germinated at different temperature for 48 h

圖6 水稻種子在不同光照環(huán)境下萌發(fā)48 h 的胚中淀粉酶活性Fig.6 Amylase activity in embryos of rice seeds germinated under light and dark conditions for 48 h

圖7 水稻種子在不同水量下吸脹48 h 的胚中淀粉酶活性Fig.7 Amylase activity in embryos of rice seeds imbibed in different water amounts for 48 hours

種子中可溶性糖通常被認(rèn)為可為種子萌發(fā)和幼苗生長提供能量，因此在種子萌發(fā)和幼苗建成階段可溶性糖呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢［10］。研究表明，可溶性糖含量在光照條件下較高；種子萌發(fā)水量的增加以及萌發(fā)溫度的升高均能顯著增加可溶性糖在種子胚中的含量（圖8）。這一結(jié)果與淀粉酶在種胚內(nèi)的變化以及萌發(fā)率的結(jié)果一致。

圖8 水稻種子在不同萌發(fā)條件下的可溶性糖含量Fig.8 Soluble sugar contents of rice seeds under different germination conditions

3 討論

應(yīng)用TTC 染色檢測種子生活力對于快速檢驗(yàn)植物種子的質(zhì)量具有重要的指導(dǎo)意義［2,11］。因此，國際種子檢驗(yàn)規(guī)程以及我國農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程均將其作為檢測種子生活力及種子活力的重要參考［4,12］。本研究將去殼的水稻種子浸于TTC 溶液中染色時，有部分種子的胚可以被染成深紅色，但也有部分種子的胚染色較淺或只有胚芽或胚根被染色，它們均被認(rèn)為是具有生活力的種子，因?yàn)閷⑵浞N胚縱切后發(fā)現(xiàn)，它們的胚也能夠完全被染色，這可能是由于TTC 染液不容易被部分種子胚吸收或種子生活力較低所致。然而萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，胚完全染色和部分染色的種子均具有較高的萌發(fā)率。因此，我們將染色程度為整個胚染色較深、整個胚染色較淺、胚根被染色、胚芽被染色的種子歸為具有生活力的種子；而種胚完全不能被染色或僅有盾片部分被染色的種子，被認(rèn)為是喪失生活力的種子，它們也無法完成萌發(fā)。需要注意的是，TTC 染色也具有一定的局限性，該方法只能區(qū)分具有生活力的種子和無生活力的種子，卻無法區(qū)分休眠種子和破眠種子［4,13］。本試驗(yàn)所使用的水稻種子是在完全打破休眠后投入使用的，因此種子生活力百分率與萌發(fā)率幾乎一致。對于有休眠特性的種子，建議將TTC 染色與種子萌發(fā)率檢測的結(jié)果作為參考使用。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)常被廣泛應(yīng)用于種子TTC 染色的最佳因素和水平篩選和優(yōu)化上［14-16］。水稻種子染色正交試驗(yàn)的極差分析和方差分析結(jié)果表明，種子吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間4 個因素均能顯著影響水稻種子染色效果。其中染色溫度和染色時間對于染色效果的影響達(dá)到極顯著水平，表明這兩個因素是決定水稻種子TTC 染色效果最關(guān)鍵的因素。這一結(jié)果與應(yīng)用TTC 溶液染色油桐［17］和南京椴［18］種子的生活力檢測結(jié)果相似，即染色溫度和染色時間對于種子染色更為重要。

一些禾谷類作物的種子在萌發(fā)過程中，淀粉酶的活性逐漸升高，植物激素脫落酸和赤霉素分別抑制和促進(jìn)種子萌發(fā)也是通過影響α-淀粉酶的活性來實(shí)現(xiàn)的［9,19-21］。本研究進(jìn)一步豐富了前人的研究結(jié)果。比如隨著加水量增加、溫度升高，淀粉酶的活性和種子萌發(fā)均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。可溶性糖作為淀粉酶水解淀粉的產(chǎn)物，其含量變化與前兩者的變化趨勢也一致，表明水稻種子在逐漸萌發(fā)過程中由于淀粉酶逐漸升高，導(dǎo)致可溶性糖含量也逐漸升高，從而為種子萌發(fā)和幼苗建成提供能量和營養(yǎng)［22-23］。

4 結(jié)論

對于水稻種子而言，TTC 染色是一種可靠、便捷的種子生活力檢測方法，按照對水稻種子染色的影響程度，依次為染色時間、染色溫度、TTC 濃度和吸水時間。TTC 染色水稻種子的最佳條件為：染色時間2 h，染色溫度30℃，TTC 濃度1%，吸水時間3 h。采用該條件對試驗(yàn)中同批次水稻種子染色，平均染色率為95.5%。在不同吸脹條件下，α-淀粉酶、β-淀粉酶活性和可溶性糖含量的變化與種子萌發(fā)率的變化呈現(xiàn)相同趨勢，或可作為預(yù)測和評價種子活力或萌發(fā)能力的重要生理指標(biāo)。