賈欽堯，宋珊，王濤，陳紹平

1川北醫(yī)學院藥學院，四川南充637000；2川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥科

支氣管哮喘是一種以可逆性氣流受限和氣道高反應性為特征的慢性氣道炎癥性疾病，長期氣道阻塞和炎癥反應可引起阻塞性肺氣腫、肺心病等，嚴重影響患者生活質量［1-3］。糖皮質激素是目前治療支氣管哮喘最有效的藥物，但長期使用可引起機體一系列不良反應［4-5］。因此，臨床醫(yī)師一直在積極地尋找能夠替代或輔助糖皮質激素的藥物。阿奇霉素是第二代大環(huán)內酯類抗生素，能夠通過抑制細菌蛋白的合成而發(fā)揮抗菌作用，可用于支氣管哮喘的輔助治療［6］。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）是體內固有免疫的重要受體。有研究報道，NLRP3炎癥小體被激活后，可使無活性的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活化，活化的Caspase-1能夠將IL-1β、IL-18前體裂解為具有生物活性的IL-1β和IL-18，從而啟動瀑布式炎癥級聯反應，加重支氣管哮喘病情［7］。在臨床治療中發(fā)現，不同支氣管哮喘患者相同方案的治療效果差異顯著。這可能與NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性有關。本研究觀察了NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性與慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1月—3月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院收治的慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者180例。所有患者符合《中國支氣管哮喘防治指南（基層版）》［8］中的診斷標準。納入標準：①符合支氣管哮喘診斷標準，臨床分期為慢性持續(xù)期；②年齡18～65歲；③病程>1年；④接受阿奇霉素治療且規(guī)律服藥；⑤臨床病歷資料完整。排除標準：①因其他呼吸系統(tǒng)疾病引起的咳嗽、喘息等癥狀者；②合并造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經精神系統(tǒng)等疾病者；③合并心、腎、肝等重要臟器功能障礙者；④治療依從性差者。所有患者在常規(guī)治療基礎上給予阿奇霉素治療3個月，根據《中國支氣管哮喘防治指南（基層版）》［8］中的哮喘控制測試（ACT）評分分為控制組（ACT評分≥19分）100例和未控制組（ACT評分<19分）80例。其中，控制組男54例、女46例，年齡20～64（52.79±7.47）歲，病程2～8（6.37±1.88）年；未控制組男45例、女35例，年齡22～61（53.54±7.31）歲，病程3～9（6.41±1.92）年。同期另選在川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院體檢健康的志愿者100例（對照組），男51例、女49例，年齡25～60（52.92±7.14）歲。三組性別、年齡具有可比性，控制組與未控制組病程亦具有可比性。本研究經川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準文號：202101040038），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者根據具體病情，給予解痙、平喘、祛痰、擴張支氣管等常規(guī)對癥支持治療，同時給予阿奇霉素口服，每次0.25 g，一周2次。當慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者最大呼氣峰流速（PEF）或第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%）恢復至個人最佳值60%以上時，可出院回家繼續(xù)治療。連續(xù)治療至少3個月。

1.3 NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性檢測 控制組與未控制組連續(xù)治療3個月后末次隨訪時，對照組體檢當日，征求研究對象或其家屬同意后進行單核苷酸多態(tài)性檢測?？刂平M、未控制組和對照組分別有90、75、92例同意參與檢測。采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，-80℃超低溫冰箱凍存。待標本成批后，提取全血基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見分光光度計鑒定，提取的基因組DNA純度和濃度合格，可用于后續(xù)實驗。借助SNP browser軟件，選擇NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648三個單核苷酸多態(tài)性位點，采用TaqMan探針法檢測基因型。根據檢測位點，設計PCR擴增引物和SNaPshot PCR延伸引物，并由廣州擎科生物技術有限公司合成。按DNA擴增試劑盒說明配制反應體系，并借助熒光定量PCR儀進行DNA擴增。擴增條件：95℃10 min，95℃15 s、60℃1 min共40個循環(huán)。PCR擴增結束，借助SDS2.0軟件采集反應信號，然后劃分基因型。若僅存在1個熒光信號增強，則為純合子；若存在2個熒光信號增強，則為雜合子。若熒光信號增強不明顯，則需重復測定。

1.4 肺功能檢測 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者連續(xù)治療3個月后末次隨訪時，于靜息狀態(tài)下，采用捷斯特CHESTGRAPHHI-10便攜式肺功能儀檢測FEV1%、第1秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比（FEV1/FVC）、PEF。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料先行Shapiro-Wilk檢驗，確定符合正態(tài)分布后以±s表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。群體代表性分析采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三 組NLRP3基 因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點基因型分布比較 三組NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點基因型的期望值和觀測值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。三組NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點基因型比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05），見表1。

表1 三組NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點基因型分布比較（例）

2.2 NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點基因型與慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的關系 以阿奇霉素治療后支氣管哮喘是否控制（是=1，否=0）為 因 變 量，以NLRP3基 因rs10754558、rs10925019、rs4925648位 點 基 因 型（GG=0，GC=1，CC=2）為自變量，納入Logistic回歸模型。結果發(fā)現，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點各基因型均為慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的影響因素（P均<0.05），見表2。

表2 NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點基因型對慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果影響的Logistic回歸分析結果

2.3 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點不同基因型者肺功能比較 見表3～5。

表3 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10754558位點不同基因型者肺功能比較（±s）

表3 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10754558位點不同基因型者肺功能比較（±s）

注：與GG基因型比較，*P<0.05；與CG基因型比較，#P<0.05。

rs10754558位點基因型CC CG GG n 44 84 37 FEV1%（%）67.15±6.13*#60.23±7.25*54.76±6.43 FEV1/FVC（%）65.55±6.25*#61.62±6.43*56.56±6.38 PEF（L/min）385.72±31.57*#346.32±40.47*309.74±41.36

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病。氣道炎癥幾乎是所有類型支氣管哮喘的共同特征，也是其臨床癥狀和氣道高反應性的基礎。糖皮質激素是治療支氣管哮喘最常用、最有效的藥物，其強效抗炎作用能夠抑制氣道炎癥反應、降低氣道高反應性。但在臨床使用中發(fā)現，糖皮質激素的使用劑量個體差異較大，長期使用可引起機體一系列不良反應［4-5］。因此，治療期間往往需要輔助用藥。大環(huán)內酯類抗生素除了具有抑菌作用外，還具有降低氣道高反應性、抑制炎癥介質釋放等作用。阿奇霉素是第二代大環(huán)內酯類抗生素，其在支氣管擴張、肺囊性纖維化等疾病中的治療效果已得到驗證。REITER等［9］研究報道，支氣管哮喘患者經大環(huán)內酯類抗生素治療后，雖然FEV1較治療前變化不明顯，但能夠明顯改善PEF，降低氣道高反應性，緩解臨床癥狀。因此，大環(huán)內酯類抗生素有可能成為支氣管哮喘的輔助治療藥物。張茂榮等［6］Meta分析發(fā)現，在常規(guī)治療基礎上使用阿奇霉素能夠改善支氣管哮喘患者FEV1、PEF，但僅能預防部分支氣管哮喘患者急性發(fā)作，在減少支氣管哮喘藥物使用、改善臨床癥狀方面效果并不明顯。因此，阿奇霉素對支氣管哮喘的治療效果仍有待于進一步研究。

表4 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10925019位點不同基因型者肺功能比較（±s）

表4 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10925019位點不同基因型者肺功能比較（±s）

注：與GG基因型比較，*P<0.05；與CG基因型比較，#P<0.05。

rs10925019位點基因型CC CG GG n 80 62 23 FEV1%（%）64.12±6.46*#61.64±6.24*55.38±6.72 FEV1/FVC（%）63.52±5.69*#60.78±6.41*57.89±6.48 PEF（L/min）378.48±38.26*#352.36±42.17*312.34±33.12

表5 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs4925648位點不同基因型者肺功能比較（±s）

表5 慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs4925648位點不同基因型者肺功能比較（±s）

注：與GG基因型比較，*P<0.05；與CG基因型比較，#P<0.05。

rs4925648位點基因型CC CG GG n 117 42 6 FEV1%（%）61.25±6.63*60.22±7.41*53.14±6.68 FEV1/FVC（%）63.55±6.45*#59.63±6.42*54.47±6.32 PEF（L/min）369.74±33.75*#332.35±42.85*294.54±36.15

NLRP3是NLRPs蛋白家族中的典型代表，主要由C端亮氨酸重復序列、N端熱蛋白結構域和中間的NACHT結構域三部分組成，通過亮氨酸重復序列識別三磷酸腺苷、內毒素、胞壁酰二肽等信號分子，使其構象發(fā)生變化，同時其N端熱蛋白結構域通過募集凋亡相關斑點樣蛋白、Caspase-1，最終形成NLRP3炎癥小體，進而引起機體異常炎癥反應［10-11］。NLRP3炎性小體異常激活已被證實與慢性阻塞性肺疾病、肺結核、肺纖維化等炎癥性疾病密切相關［12-13］。有證據表明，NLRP3炎性小體在支氣管哮喘氣道炎癥反應中發(fā)揮重要作用［14］。急性發(fā)作期支氣管哮喘患者肺組織NLRP3 mRNA表達高于慢性持續(xù)期，經有效治療后NLRP3 mRNA表達可明顯降低。因此，NLRP3 mRNA表達能夠反映支氣管哮喘嚴重程度和治療效果［13］。

本研究選擇NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648三個單核苷酸多態(tài)性位點［13，15］，并對控制組、未控制組和對照組這三個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型進行分析，結果發(fā)現三個位點基因型的期望值和觀測值具有可比性，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明研究對象具有群體代表性。本研究結果發(fā)現，控制組、未控制組和對 照 組NLRP3基 因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點基因型比較差異均有統(tǒng)計學意義，提示NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性與慢性持續(xù)期支氣管哮喘發(fā)生有關。Logistic回歸分析發(fā)現，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點各基因型均為慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的影響因素，證實NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性與阿奇霉素治療慢性持續(xù)期支氣管哮喘的臨床效果有關。進一步研究發(fā)現，慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點不同基因型者FEV1%、FEV1/FVC、PEF比較差異均有統(tǒng)計學意義。其中，慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者NLRP3基因三個位點純合子CC基因型者FEV1%、FEV1/FVC、PEF水平最佳。提示NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點基因型與慢性持續(xù)期支氣管哮喘患者的肺功能關系密切。胡向陽等［16］研究報道，冠狀動脈粥樣硬化患者NLRP3基因rs10754558位點GG、GC基因型者血清ET-1、E選擇素水平明顯高于CC基因型者，而血清NO水平明顯低于CC基因型者，表明GG、GC基因型可能通過激活炎癥反應而促進疾病進展。由此推測，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點GG或GC基因型能夠激活NLRP3炎性小體，促進炎癥因子釋放，通過激活炎癥反應而促進支氣管哮喘病情進展，繼而影響阿奇霉素的治療效果。但對于NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點影響慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素治療效果的具體機制還需要進一步探索。

綜上所述，NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點單核苷酸多態(tài)性與慢性持續(xù)期支氣管哮喘阿奇霉素的治療效果密切相關；NLRP3基因rs10754558、rs10925019、rs4925648位點純合子CC基因型越多，阿奇霉素的治療效果越好。